溶酶体自噬途径降解α－synuclein蛋白作用研究

王润青 赵 杰△ 张晓曼 刘 威 赵松耀 秦晓明 赵美英 孟宏音

1）郑州市中心医院神经内科 郑州 450007 2）郑州市第一人民医院神经内科 郑州 450006

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是当今最为广泛的神经退行性疾病之一，在全世界40岁以上人口中，有超过0.1%的人受到该疾病影响。20世纪60～80年代，生物学研究主要集中在核酸及蛋白质的翻译上，蛋白质的降解则被人们忽视，误认为是一个非特异的终端过程。近年来，随着对细胞内蛋白降解途径的深入研究发现蛋白降解是一个复杂、缜密的调控过程，是细胞调控的重要机制。α－synuclein蛋白降解也不例外，众多研究表明蛋白酶体抑制剂可诱导多巴胺能神经元细胞死亡和细胞内α－synuclein蛋白聚集包涵体形成，证明蛋白酶体通路影响α－synuclein蛋白降解，但作为细胞内另外一条蛋白降解途径——溶酶体途径对α－synuclein蛋白降解的影响研究比较匮乏。本研究通过观察溶酶体抑制剂E64对α－synuclein蛋白聚集、降解的影响，以揭示α－synuclein蛋白可通过溶酶体途径降解，为明确PD发病机制和寻找新的治疗方法提供实验依据和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞：大鼠嗜铬细胞瘤细胞系（PC12细胞）由武汉大学典型培养物储藏中心提供。

1.1.2 实验试剂：DMEM 培养基、小牛血清、马血清购自Gilbco公司，鼠源神经生长因子（NGF）购自厦门北大之路生物工程有限公司，E64、硫磺素S、二甲基亚砜（DMSO）、鱼藤酮（Rotenone）购于美国Sigma公司，山羊抗大鼠α－synuclein蛋白抗体和兔抗大鼠LAMP2抗体均购自Santa Cruz公司，TRITC和FITC标记荧光二抗均购自北京中杉金桥生物试剂有限公司，其余试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：PC12细胞置于DMEM 培养基中，内含10%（体积分数）灭活小牛血清及5%的马血清、青霉素100 U／mL、链霉素100U／mL，于5%（体积分数）CO2、37℃培养箱内进行培养，隔天换液。药物处理前1周用NGF（终浓度为50ng／mL）诱导PC12细胞神经元样分化，处理当天将Rotenone配制成1mmol／L的母液，E64配成10mmol／L的 母 液，Rotenone、E64 终 浓 度 分 别 为 100nmol／L、200 mmol／L，用于以下实验。

1.2.2 免疫荧光细胞化学方法检测胞质内α－synuclein蛋白和硫磺素阳性包涵体：本实验分组如下：①正常组即未加任何药物组。②Rotenone处理48h组。③撤除Rotenone继续自然孵育48h组，此组作为对照组。④撤除Rotenone后加入E64继续孵育48h组。具体如下：将细胞接种到铺有盖玻片的24孔板内，待进入对数生长期后加入100nmol／L Rotenone处理48h后再换液撤除Rotenone并加入终浓度为200μmol／L的E64，继续孵育48h后取出盖玻片，常规处理后用冷丙酮／无水乙醇（体积比1∶1混合）室温固定细胞10 min；加入2‰Triton X－100（体积分数）的PBS溶液室温作用20min；用0.1%硫磺素S孵育10min，之后移入80%的酒精分化5min，振荡洗涤入3%牛血清白蛋白（BSA）室温作用30min；吸出多余液体，加入山羊抗大鼠α－synuclein蛋白抗体（1∶100），4°C孵育过夜，阴性对照组用PBS代替一抗；加入TRITC标记的兔抗山羊荧光二抗（1∶100）室温避光孵育90min；anti－fade处理。每步后皆用PBS洗涤5min×3。荧光显微镜下及其相连的计算机图像处理系统中观察胞质内α－synuclein蛋白和硫磺素S阳性包涵体的形成。用计算机图像处理系统拍照和图片处理。每次每组实验设四个复孔，每组实验重复3次。双阳性包涵体的细胞计数是在显微镜下以每孔中心十字为界，随机选取多个视野，每组观察10个视野，计数含有双阳性包涵体的细胞百分数（细胞中含有α－synuclein蛋白和硫磺素S染色阳性包涵体细胞个数／每个视野的细胞总数×100% ）。

1.3 统计学处理 所有数据应用SPSS 12.0统计软件分析，数据结果采用均数±标准差（）表示，各实验组与对照组均数差异显著性用Dunnett法，多组间比较先行方差齐性检验，方差齐者行方差分析；方差不齐者行成组秩和检验，组间比较用Student－Newman－Keuls法检验。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

免疫荧光细胞化学方法检测药物Rotenone及撤除Rotenone后E64处理PC12细胞48h后胞质内α－synuclein蛋白和硫磺素S阳性包涵体情况：正常组PC12细胞中仅有少数细胞中含有α－synuclein蛋白和硫磺素S染色双阳性的细胞包涵体（3.26±0.32）%；经100nmol／L Rotenone处理48 h后含有双阳性包涵体的数目明显增加（21.15±1.58）%，撤除Rotenone后再培养48h后包涵体数目又明显减少（7.23±0.75）%，上述三组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），说明α－synuclein蛋白模型成功建立。撤除Rotenone后再经终浓度为200mmol／L E64处理48h后，含有阳性包涵体的细胞数目为：（15.36±0.85）%，与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

α－synuclein蛋白是路易小体的重要组分，与帕金森病发病机制密切相关，目前研究表明α－synuclein蛋白聚集主要与其降解障碍有关。但是蛋白酶体或是溶酶体降解α－synuclein，或者是两者的共同作用尚不十分清楚。最近有研究显示α－synuclein蛋白存在蛋白酶体和溶酶体两条降解途径［1－2］。最近又有研究显示体内存在α－synuclein蛋白酶体降解途径和溶酶体降解途径的分子开关CHIP［3］。

目前研究已经明确鱼藤酮处理PC12细胞后α－synuclein蛋白增加且可以出现α－synuclein蛋白聚集，而去除鱼藤酮后细胞内聚集物又可消失［4］。本试验利用鱼藤酮这一特性成功建立α－synuclein蛋白模型。我们研究发现应用溶酶体途径抑制剂E64作用于鱼藤酮处理后的PC12细胞显示：E64处理组出现α－synuclein明显聚集且包涵体形成；依此分析αsynuclein蛋白可通过溶酶体途径降解，另有研究显示α－synuclein聚集后具有细胞毒性［5］，Ana Maria Cuervo等研究发现α－synuclein形成蛋白聚集体后，就会阻断分子介导的自吞噬途径，使溶酶体无法降解其他酶解底物，从而干扰其正常的细胞清除功能，并导致自吞噬作用的补偿性激活［6］。因此我们推测自噬也可能参与了细胞的死亡过程。但到底是什么原因导致了神经元最后的死亡，众多研究表明，由α－synuclein积聚所形成的包涵体在一定程度上通过细胞凋亡途径而导致多巴胺能神经元死亡。激活自噬加速新合成的蛋白聚集物清除已经得到实验证实［2，7］。然而，随着疾病的进展，蛋白聚集物越来越多，它们对溶酶体蛋白酶降解的敏感性下降或者溶酶体本身功能的下降，自噬的持续性激活将导致细胞最终发生自噬性程序性细胞死亡。由此推测细胞死亡的原因可能也与细胞溶酶体功能的下降引起蛋白聚集和自噬的持续性激活有关。而且不可否认的是溶酶体功能确实有随年龄增长而逐渐下降的趋势。巧合的是有一种早发性家族性PD伴有遗传性溶酶体贮积症［8］，有溶酶体贮积症患者伴有帕金森综合征［9］。另有研究发现α－synuclein蛋白聚集也影响溶酶体功能，神经元中变异α－synuclein表达引起溶酶体功能的失调和泛素依赖性的蛋白水解系统的破坏［10］。说明溶酶体功能下降与α－synuclein蛋白聚集之间相互影响，相互促进，形成恶性循环。

目前研究越来越多的证据证明程序性细胞死亡不仅仅局限于凋亡，自噬为主的II型程序性死亡（PCD）也占据了重要的位置。凋亡与自噬／溶酶体途径引起的细胞死亡之间并不是完全各自独立，而有着大量的信号交叉。因此可以推测可能凋亡和自噬共同参与了多巴胺神经元的变性死亡。激活自噬可加速细胞内蛋白聚合物的清除，而这种蛋白聚合物的存在是神经变性性疾病的典型特点之一［11－12］，但过度自噬又引起II型PCD。

本研究应用农业中广泛使用的杀虫剂之一鱼藤酮建立α－synuclein蛋白模型，较以往研究者用转染α－synuclein基因建立α－synuclein蛋白过表达模型更接近于体内真实情况，某些α－synuclein基因突变可引起家族性PD已得到证实，本研究把引起PD遗传因素和环境因素有机结合了起来。另本研究结果显示α－synuclein蛋白可通过溶酶体途径降解，溶酶体途径根据底物进入溶酶体的方式不同分为3种类型：微自噬（microautophgy）、巨自噬（macroautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone－mediated autophagy，CMA）。我们下一步将对α－synuclein蛋白溶酶体具体降解途径及自噬的调控机制进一步深入研究。经过上述讨论及结合我们的试验结果，提示凋亡和自噬可能共同参与了DA能神经元的变性死亡。深入了解DA能神经元的II型PCD机制，将为PD的治疗和预防及发病机制的阐明提供一个新的思路。

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