高效液相色谱法检测酸奶与奶酪中纳他霉素残留

吴 旭，张雪峰，其其格，常建军，姜瑞清，郭建敏

（内蒙古呼和浩特市盛乐经济园区蒙牛乳业（集团）有限公司，内蒙古 呼和浩特 011500）

纳他霉素（natamycin）又称游霉素（pimaricin），是多烯大环内酯类抗真菌剂。纳他霉素纯净物纳他霉素作为天然食品防腐剂，既可以抑制各种霉菌、酵母菌的生长，也可抑制真菌毒素的产生[1-3]。纳他霉素对人体无害，很难被人体消化道吸收，而且微生物很难对其产生抗性，同时因为其溶解度很低等特点，通常用于食品的表面防腐[4-7]。纳他霉素是目前国际上唯一的抗真菌微生物防腐剂。已被批准应用于食品工业中。根据我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760-2007）规定，纳他霉素在食物中最大残留量为0.3g/kg。目前该产品已经在50多个国家得到广泛使用。主要应用于乳制品、肉制品、发酵酒、饮料等食品的生产和保藏[8]。

目前纳他霉素的分析方法主要有高效液相色谱法，且该方法已经列入国标方法，此方法消除样品基质干扰峰的干扰，并且实现较为准确的测定。 本文建立了一种新型快速检测奶酪和酸奶中纳他霉素残留的方法，本方法稳定性好、回收率高，适用于监控奶酪和酸奶中纳他霉素残留，更适合于大批量检测。

1 材料与方法

1.1 材料 甲醇（HPLC级）、冰乙酸

（优级纯）、乙酸水提取液（冰醋酸:水5:40）、乙酸铵（优级纯）均购自天津市科密欧化学试剂开发中心；那他霉素（纯度＞95%，sigma公司）；乙睛（色谱纯，迪马公司）；水（超纯）。

1.2 仪器

Waters 1525液相色谱（配有二极管阵列测器）；Agela C18色谱柱（5μm，4.6×250mm）；漩涡混合仪；超声波机；高速离心机（不低于8000 r/min）。

1.3 仪器方法

流动相:甲醇:水:乙酸＝60:40:5（体积比），检测波长302nm，流速1mL/min，柱温 30 ℃，进样量 20μL。

1.4 标准溶液配制

精确称取纳他霉素标准品0.0100g，用冰醋酸:水（5:40为体积比）溶解，定容到100mL。浓度为100ug/mL，避光4℃保存。

1.5 试样制备

1.5.1 酸奶样品

准确称取10g试样（精确到0.01 g），加入乙酸水溶液25mL，剧烈振摇2min，10000 r/min离心，上清液用0.45μ水系微孔滤膜过滤后待用。

1.5.2 奶酪样品

称取样品2.5 g试样于研钵中，加入适量海砂（试样质量的4～6倍）研磨成干粉状，加入乙酸水溶液25mL，剧烈振摇2min，充分混匀后超声20min。10000 r/min离心，上清液用0.45μm水系微孔滤膜过滤后待用。

2 结果与讨论

2.1 检测波长确定

将纳他霉素的标准品溶解于冰醋酸:水（5:40为体积比）中，制备成浓度4 mg／L的溶液，在200～400nm的波长范围进行紫外光全波长扫描（图1），从光谱图中看出，纳他霉素的最大吸收波长为302nm，故选择302nm作为检测波长。

2.2 流动相和流速的选择

本文通过选择3种流动相进行实验比较:A.甲醇:水:乙酸＝60:40:5（体积比）；B.甲醇:水:磷酸 =70:30:0.5（体积比）；C.0.053moL/L乙酸铵:乙睛=80:20（体积比）。通过大量实验筛选得出，此三种方法都能将酸奶和奶酪当中的纳他霉素分开，但B方法纳他霉素保留较弱，且在进样后基线波动较大，考虑到乙睛价格较高，在A和C方法中选择A方法。

流速的选择:对不同流速（0.80、1.0、1.2mL/min）条件下的分离情况进行研究。与1.00mL/min相比较，流速为0.80mL/min时保留时间增加；流速为1.20mL/min时保留时间缩短，但不明显，且分离效果与1.00mL/min相差不大。考虑到柱压的因素，因此最终选用流速为1.00mL/min。

2.3 标准曲线绘制

用纳他霉素对照储备液分别稀释为 0.10、0.50、1.00、2.00、20.00mg／L，在上述优化的色谱条件下进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作标准曲线，结果见图2。线型方程为:y＝4.68×105-1.33×104相关系数 r2＝0.9999。

2.4 精密度

对同一个3 mg/kg酸奶加标样品进行了7次测定，并计算标准偏差及CV%值，结果见表1。

2.5 回收率实验

选用3种不同浓度分别进行了纳他霉素的加标回收率测定（见表2）。

通过测试酸奶中纳他霉素检测的回收率在90～110%之间，完全能满足检测的需要。

?

3 结论

选用甲醇:水:冰乙酸（体积比60:40:5）作为方法的流动相，不仅能将纳他霉素分开，且方法用水:冰乙酸（体积比40:5）作为样品的提取溶液，与流动相匹配性好，回收率好，提取较完全。酸奶和奶酪中纳他霉素含量范围在0.5～20mg/kg时与峰面积呈良好的线性关系（r2＝0.9999）。回收率在90.3～95.6%（n=7）之间，相对标准偏差（RSD）1.01%，结果表明该方法有准确度高、重现性好的特点，特别是操作简便、快捷，可以作为企业生产监控的有效方法。

[1]Pedersen J C.Natamycin as a fungicide in agar media [J].Appl Environ Microbiol，1992，58:1064.

[2]Kiedmeier F.Zum einsatz von pimaricin zur verhinderungder schimmelpilz entwicklung auf lebensmitte ln[J].Zlebensm Unters Forsch，1973，151:179.

[3]Davidson P M，Doan C H.Natamycin[M]//Antimicrobials in foods.New York:Basel and HongKong:Marcel Dekker，Inc，1993，395.

[4]袁亦丞.纳他霉素[J].中国食品应用化学，1997，1（3）:37.

[5]Gill J A，Martin J F.Polyeneantibiotics.Biotechnology of antibiotics（2nd edu） [M].NewYork:MarcelDekker，1997:511-576.

[6]The United States Pharmacopoeial Convention Inc.The United States Pharmacopoeia.XXIIL[S].Natamycin.

[7]王克利，张宣义，刘醇，等.HPLC法测定沙拉酱和干酪中纳他霉素含量方法的研究[J].中国卫生检验杂志，1998，8（6）:38.

[8]黄孟基，郭新东，王永华，等.高效液相色谱法测定月饼中纳他霉素残留[J].食品与发酵工业，2006，32（5）:121-123.