甜菜SRAP扩增产物两种不同检测方法的比较

吴则东,王华忠，韩 英

（1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室，哈尔滨150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨 150080；3.中国农业科学院甜菜研究所/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080）

分子生物学的快速发展，使基于PCR扩增反应的分子标记技术得到了广泛的应用，如品种纯度的鉴定[1]、QTL定位[2]、分子标记辅助育种、植物遗传图谱构建[3]、遗传多样性评价[4,5,6]、基因定位、杂种优势预测以及比较基因组学[7]等方面。目前的分子标记技术方法有许多，常使用的有RAPD、AFLP、SSR和SRAP。RAPD作为一种较早的分子标记方法，因其操作简便而得到了快速的应用，但是由于其稳定性、重复性差，产率低等缺点而限制了其发展应用。而SSR是一种由2～5个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于整个真核生物基因组的不同座位上，在真核生物中大约每隔10～50 kb就存在1个微卫星。SSR扩增得到的多为共显性标记，但是其引物的开发费时昂贵而在一定程度上限制了它的发展。AFLP结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性，AFLP以其精确有效得到了广泛的应用，但此技术操作复杂，受到专利保护，而且试剂盒价格昂贵，对样品DNA质量要求严格，而使其应用受到限制；而SRAP[8]是一种基于PCR的新型标记，由美国加州大学蔬菜作物系Li和Quiros于2001年在研究芸薹属作物中开发的，SRAP与其他基于PCR的分子标记相比，独特之处就在于它的引物设计。SRAP引物是针对基因组成的一些特点而设计，即外显子一般位于富含GC区域，在不同个体中通常是保守的，而内含子、启动子则处于富含AT区域，在不同物种甚至不同个体间变异很大。因此正向引物针对序列相对保守的外显子，使用“CCGG”序列就可以特异扩增出含这些组分的序列；反向引物针对变异大的内含子、启动子和间隔序列，使用“AATT”序列以特异结合富含AT区。因此，该标记通过独特的引物设计优先扩增基因组内的开放阅读框（ORFs）。正、反向引物分别与外显子和启动子（或内含子）区域配对，因不同物种、不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性[9]。该标记具有简便高效、产率高、共显性高、重复性好、易测序、便于克隆目标片段的特点而得到了广泛的应用，SRAP主要包括模板制备、PCR扩增、产物检测几个主要步骤。就产物检测而言，目前主要用大板变性聚丙烯酰胺凝胶（4%～6%，含8mol/L尿素）电泳分离，采用银染显色。也可用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，但可分辨的条带较少[10]，有的研究者也采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，进行银染检测[11]。本研究通过对6种甜菜二倍体的SRAP扩增产物变性及非变性胶的检测进行比较，以期找到一种省时、高效、分辨率高、重复性好的检测方法，为将来SRAP在甜菜属的大量应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

甜菜二倍体品系 6 个，代号为 TB001、TB002、TB003、TB004、TB005、TB006，均由黑龙江大学甜菜遗传改良重点实验室多倍体课题组提供。2006年4月29日播种，7月8日上午取样，各材料分别选取5株生长健壮的个体，选取甜菜的中心嫩叶，然后放于小袋中。用冷冻真空干燥机（modnlyo D型）进行干燥，待样品充分干燥后取出，用离心管密封保存。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取 取每个样品的干粉，采用CTAB法提取基因组DNA。提取的DNA样品经含有0.5μg/L溴化乙锭的 0.8%琼脂糖电泳检测 （每个孔道加 1μL样品 DNA、4μL ddH2O、1μL 6×Loading Buffer），结果用凝胶成像系统检测（凝胶成像仪由Bio-RAD公司生产），最后根据和λDNA检测浓度的结果比对，将样品DNA浓度稀释为40ng/μL，用于SRAP分析。

1.2.2 SRAP-PCR扩增 SRAP引物采用Li等[8]已发表的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。通过筛选采用了Me2与Em1的组合，其中正向引物Me2序列为:5'-TGAGTCCAAACCGGAGC-3'，反向引物Em1序列为:5'-GACTGCGTACGAATTAAT-3'。PCR（PCR仪为PTC-100）反应程序为，在20μL SSRPCR 反应体系中， 加入 2.5mmol/L 的 dNTP 1μL，5U/μL Taq DNA 聚合酶 0.1μL，50ng/μL 的引物各 0.8μL，40ng模板DNA，10×PCR Buffer 2μL，最后用重蒸水调整体系使终体积为20μL，最后加1滴灭菌的石蜡油，盖上盖板。反应程序为94℃预变性4 min，94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5min，30个循环，最后72℃延伸 10min，4℃保存。

1.3 PAGE电泳检测

1.3.1 变性PAGE电泳检测 （1）电泳：扩增产物4μL加2μL 10倍上样缓冲液（47.5mL甲酰胺、2.0mL的0.5M EDTA、溴酚蓝0.125g、定容到50mL），95℃变性5min，取出后置于冰水混合物中迅速冷却，用6%变性聚丙烯酰胺凝胶（丙烯酰胺 57.0g、甲叉双丙烯酰胺 3.0g、10×TBE 100.0μL、尿素 420.42g、加水至 900mL，搅拌使其完全溶解，定容至1000mL）60mL，加入50μL的TEMED和300μL 10%的过硫酸铵混匀，然后灌胶，垂直板电泳槽和电泳仪由Bio-RAD公司生产；dNTP、Taq聚合酶、10×PCR Buffer购自百泰克生物技术有限公司。

（2）银染方法：①电泳结束后，轻轻取下长板，将长板放入2L 10%的醋酸溶液中，轻轻摇动30min，蒸馏水中漂洗2次，每次3min；②染色（在2L蒸馏水中加入2g硝酸银，3mL甲醛）30min；③染色完毕后在蒸馏水中迅速漂洗3～4s，转入预冷的碳酸钠溶液中（其中含有3mL甲醛，400μL 10mg/mL的硫代硫酸钠），在摇床上显影至条带清晰为止。

1.3.2 非变性PAGE电泳检测 （1）电泳：20μL体系中加入非变性的双色上样缓冲液（非变性指示剂100mL水中加入40g蔗糖，0.125g二甲苯菁，0.125g溴酚蓝）6μL，PCR产物14μL，采用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行灌胶，其中垂直板电泳槽是北京市六一仪器厂的，型号是DYCZ-30。电泳仪由Bio-RAD公司生产。

（2）非变性胶的银染方法：电泳结束后，将胶轻轻剥下。①固定：将胶置于100mL固定液中（10%无水乙醇，0.5%冰乙酸），脱色摇床上缓慢摇动 6min，2次。②银染：倒去固定液，加入100mL 0.2%AgNO3溶液，脱色摇床上缓慢摇动 12min。③清洗：倒去AgNO3溶液，用100mL ddH2O清洗30s。④降低背景：加入0.002%硫代硫酸钠100mL，脱色摇床上缓慢摇动30s后倒去。⑤显色：加入100mL显色液（1.5%氢氧化钠，0.4%甲醛），脱色摇床上缓慢摇动至肉眼看到清晰的DNA条带。⑥照相：用数码相机进行记录。

图1 非变性胶

图2 变性胶

2 结果与分析

比较图1和图2（其中的序号对应甜菜样品的序号）可知，二者均为银染，虽然电泳过程不同，染色方法不同，但从图中我们可以看出，二者在主带上没有差异，仅在一些弱带上略有不同，其分辨率差异不大，但相比较而言，非变性胶可以在短时间内得到检测结果，而且易操作。

3 讨论

甜菜做为小作物，国内在基础方面的研究比较薄弱，尤其是在分子水平上的研究则更是较少，近年来，国家加大了甜菜科研的投资力度，国家甜菜产业体系建设项目的大额投入使得甜菜分子生物学方面的进一步研究成为可能，如甜菜品种纯度的鉴定、QTL定位、分子标记辅助育种以及甜菜遗传图谱的构建等等，这些都需要利用分子标记技术，而目前分子标记技术实用性能较好的要数SRAP，过去科研工作者在做SRAP分子标记的时候，经常使用的是变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用伯乐的垂直板灌胶，这种灌胶的方法需要涂亲和与剥离，灌胶的过程也较为复杂，PCR的产物也需要变性处理，银染的过程也较为复杂，需要使用摇床，整个流程下来需要1个多小时的时间，具有较高的专业性；而非变性胶的灌制则比较简单，只需要用琼脂糖封底，凝固后稍微倾斜一下把配好的胶倒到两个板子中间，再插上梳子，等待凝固，凝固后拔掉梳子，加缓冲液点样即可，非变性胶的显色过程也比较简单，因为胶比较小，所以只需要一个小的搪瓷盘，大约在30min之内即可完成。而通过对非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色发现，这两种方法显示的结果分辨率差异不大，但由于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳具有灌胶简单易学，显色时间短，节省药品等特点，可以作为今后甜菜SRAP电泳及显色的首选方法。

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