新型环糊精衍生物HPn-SBEm-β-CD动物血管给药的生物效应评价

王晖，陈乘，周成梁，余书勤

(南京师范大学生命科学学院，江苏省医药超分子材料及应用重点实验室，江苏南京 210046)

环糊精(cyclodextrin，CD)系淀粉经环糊精葡聚糖转位酶酶解环合后得到的由6～15个葡萄糖分子连接而成的环状低聚糖天然产物［1－3］，常见的有 α -、β -和γ-CD，使用最为广泛的是β-CD。但由于其溶解度小、溶血作用强、非肠道给药不仅刺激性强还具有明显的肾毒性，因此，只适合口服而不能用于非肠道给药［4］。为了克服天然β-CD环糊精的缺点，一系列β-CD环糊精衍生物被合成。作为药用辅料，环糊精衍生物(CDD)具有增加药物的溶解度及稳定性、提高药物的生物利用度、控制药物的释放速率等优点，应用越来越广泛，其中2个重要的衍生物分别是羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)和磺丁基醚-β-环糊精(SBE-β-CD)［5］，二者均具有水溶性好、肾毒性低、溶血作用小及局部刺激性轻微等特点。

本实验室新合成的环糊精衍生物HPn-SBEm-β-CD是以羟丙基和磺丁基混合取代的环糊精衍生物，研究人员期望其在理化性质、性能和安全性方面均优于HP-β-CD和SBE-β-CD。已有实验证明，其溶解性好，包合药物能力较强，有极好的应用前景，但安全性值得关注。本实验主要研究HPn-SBEm-β-CD经血管给药后对红细胞的毒性和对动物的神经精神系统、心血管和呼吸系统的影响。

1 材料与方法

1． 1 材料

1．1．1 实验动物 (1)昆明种小鼠，体重18～22 g，雌雄各半，由东南大学医学院实验动物中心提供，饲养温度22～26℃，小鼠饲养3 d后使用。(2)Beagle犬由苏州西山中科实验动物有限公司提供。(3)健康新西兰大白兔由东南大学医学院实验动物中心提供，体重约2．0 kg。实验前对所有动物称重并观察进食量、一般行为表现以确认受试动物健康。

1．1．2 药物与试剂 不同取代度的 HPn-SBEm-β-CD由江苏省医药超分子材料与应用重点实验室合成;盐酸氯丙嗪注射液(北京永康制药厂);β-CD、SBE7-β-CD(TCI，日本);HP-β -CD、M-β -CD(南京德宝生化器材有限公司);戊巴比妥钠(上海化学试剂公司分装)，戊二醛溶液(Sigma，美国)，其余试剂均为国产分析纯。

1．1．3 仪器 低温离心机(Centrifuge 5417R型，德国Eppendorf)，扫描电子显微镜(JSM-5610LV型，日本电子公司)，离心沉淀机(LDZ5-2型，北京医用离心机厂)，可见紫外分光光度计(UV-2450，日本岛津)，恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，六光道SYS-I型小鼠自发活动测定仪(自制)，RM-6000型多导生理记录仪(日本光电);WDT-204型自动平衡记录仪(上海大华仪表厂)。

1． 2 方法

1．2．1 HPn-SBEm-β-CD 的溶血试验［6］取新鲜兔血10 ml置于洁净三角瓶中，玻璃棒搅拌10 min去除纤维，加入约20倍生理盐水置于离心机中，以1500 r·min－1离心3 min，除去上清液，如此反复洗涤直到上清液澄清为止。将制备的红细胞以生理盐水配制成5%(V/V)悬浮液。

由于 β-CD溶解度差，故浓度梯度设为1、6、12 mmol·L－1，而11 种不同取代度的 HPn-SBEm-β -CD、HP-β -CD、SBE7-β -CD 浓度梯度设为1、6、12、25、35 mmol·L－1，红细胞与各种环糊精在37℃下振摇作用 30 min，冷却，以 2 500 r·min－1离心 5 min，取上清液于λ=543 nm处测定紫外吸收值，溶血百分率的计算公式如下:溶血百分率=(A受试物－A阴性对照)/A阳性对照×100%

1．2．2 扫描电镜观察HPn-SBEm-β-CD对红细胞形态的影响 观察方法参照文献［7］。红细胞悬液制备方法同溶血试验。本实验选取HP3-SBE2-β-CD作为受试物，M-β-CD为对照。将配好的两种环糊精溶液与红细胞悬液以1∶1混合，使其终浓度都分别为10、5和2．5 mmol·L－1，然后37 ℃ 水浴。1 h后将各管中的液体以1 500 r·min－1离心 5 min，弃上清，PBS 洗两遍。各管中分别加入适量的2．5%戊二醛溶液，于4℃ 固定12 h以上。PBS洗两遍，将红细胞重悬到适当浓度进行细胞涂片，之后进行30%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水，每步10 min。样品片剪为大小合适的小片，黏附于载物台上镀金，扫描电镜观察。

1．2．3 HPn-SBEm-β-CD 对小鼠神经精神系统的影响［8－9］(1)对小鼠一般行为的影响。取小鼠40只，随机分为4组，即HP4-SBE3-β-CD 3个剂量组(80、160、320 mg·kg－1)和对照组;观察各给药组在静脉注射给药后小鼠的行为表现、姿势、步态、被毛、饮食、大小便、眼、黏膜、瞳孔等变化。(2)对小鼠自主活动次数的影响。取健康小鼠，预选5 min内活动次数在220～320之间的共50只，随机分为5组，即空白对照组、阳性对照组(氯丙嗪 2 mg·kg－1)、HP4-SBE3-β -CD 3 个剂量组(80、160、320 mg·kg－1)。静脉注射给药，用六光道自发活动仪分别记录给药后即刻、30、60、120及180 min的小鼠5 min内的自主活动次数。

1．2．4 HPn-SBEm-β-CD 对麻醉犬呼吸系统及心血管系统的影响［9］取Beagle犬24只，随机分为4组，即空白对照组和HP4-SBE3-β-CD 3个剂量组(40、80、160 mg·kg－1)。以戊巴比妥钠 40 mg·kg－1腹腔注射麻醉后，背位固定，右颈总动脉插管连接TP-101型压力换能器记录收缩压(SAP)舒张压(DAP)及平均动脉压(MAP);针形电极刺入皮下记录Ⅱ导联心电图(ECG);气管插管连接呼吸换能器，记录呼吸频率及幅度。术后稳定20 min，用多导生理记录仪记录上述各项指标，作为给药前基础值。然后静脉注射给药后30、60、120及180 min时记录上述各项指标，观察呼吸频率、幅度及心电、心率和血压的变化。

1． 3 统计学处理

2 结 果

2． 1 HPn-SBEm-β -CD 的溶血试验

本实验以 β-CD 、HP-β-CD 、SBE7-β-CD 为对照，进行溶血试验。结果表明:在测试浓度下，所有化合物的溶血性均远远小于β-CD;多数化合物的溶血性小于对照品 HP-β-CD;化合物HP2-SBE3-β-CD、HP1-SBE4-β-CD、HP3-SBE6-β-CD 等的溶血性小于SBE7-β -CD;少量化合物在浓度 ＞25 mmol·L－1时溶血性大于HP-β-CD。见图1～3。

2． 2 红细胞形态变化

扫描电镜结果显示，5 mmol·L－1和10 mmol·L－1的HP3-SBE2-β -CD 对红细胞形态无影响，2．5 mmol·L－1的M-β-CD使红细胞形状发生了改变，而且细胞浓度降低，而5 mmol·L－1的M-β-CD完全破坏了细胞膜的完整性，几乎看不到正常的红细胞形态。见图4。

图1 HP-β-CD、HP1-SBE4-β-CD、HP2-SBE3-β-CD、HP3-SBE6-β-CD、SBE7-β-CD溶血性试验结果Fig 1 Hemolytic activity results of HP-β -CD，HP1-SBE4-β -CD，HP2-SBE3-β -CD，HP3-SBE6-β -CD，SBE7-β -CD

图2 β-CD、HP-β-CD、HP5-SBE3-β-CD、HP4-SBE2-β-CD、HP4-SBE3-β-CD、HP2-SBE2-β-CD溶血性试验结果Fig 2 Hemolytic activity results of β -CD，HP-β -CD，HP5-SBE3-β -CD，HP4-SBE2-β -CD，HP4-SBE3-β -CD，HP2-SBE2-β -CD

图3 β-CD、HP-β-CD、HP3-SBE2-β-CD、HP5-SBE2-β-CD、HP3-SBE4-β-CD、HP6-SBE2-β-CD溶血性试验结果Fig 3 Hemolytic activity results of β -CD，HP-β -CD，HP3-SBE2-β -CD，HP5-SBE2-β -CD，HP3-SBE4-β -CD，HP6-SBE2-β -CD

图4 扫描电镜观察各种环糊精作用下兔血红细胞的形态Fig 4 Effects of different CD on morphological changes of RBC by SEM

2． 3 HP4-SBE3-β-CD对小鼠神经精神系统的影响

2．3．1 对小鼠一般行为的影响 小鼠分别静脉注射80、160 及 320 mg·kg－1HP4-SBE3-β -CD 后，其行为表现、活动姿势、被毛、饮食、大小便、黏膜、瞳孔均未见异常，与对照组比较差异无统计学意义(P＞0．05)，表明HP4-SBE3-β-CD对小鼠一般行为无明显影响。

2．3．2 对小鼠自发活动次数的影响 小鼠分别静脉注射 80、160 及320 mg·kg－1HP4-SBE3-β -CD 后，其自发活动次数各时间点与对照组比较差异无统计学意义(P ＞0．05)，给予氯丙嗪(2 mg·kg－1)的小鼠自发活动次数与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)，表明HP4-SBE3-β-CD对小鼠自发活动无明显影响。见表1。

表1 HP4-SBE3-β-CD对小鼠自发活动的影响Tab 1 Effects of HP4-SBE3-β-CD on spontaneous action of mouse次·(5 min)－1

表1 HP4-SBE3-β-CD对小鼠自发活动的影响Tab 1 Effects of HP4-SBE3-β-CD on spontaneous action of mouse次·(5 min)－1

与对照组比较，a P ＞0．05，b P ＞0．05

组 别 n用药后不同时间自发活动10 316±46 277±46 225±55 187±24 170±36 HP4-SBE3-β -CD 组80 mg·kg－1 10 319±50 246±79a 225±38a 179±20a 166±45a 160 mg·kg－1 10 289±43 227±70a 207±63a 181±40a 150±48a 320 mg·kg－1 10 296±43 248±59a 206±56a 193±41a 146±53a氯丙嗪组 10 302±75 57±40b 16±20b 22±19b 25±28 30 min 60 min 120 min 180 min对照组用药前自发活动b

2． 4 HP4-SBE3-β-CD对麻醉犬呼吸及心血管系统的影响

2．4．1 对呼吸系统的影响 分别静脉注射40、80、160 mg·kg－1的 HP4-SBE3-β -CD 后，各时间点麻醉犬的呼吸频率、幅度与对照组比较差异无统计学意义(P＞0．05)，用药后与用药前比较差异也无统计学意义(P＞0．05)，表明 HP4-SBE3-β-CD 对麻醉犬呼吸系统无明显影响。见表2。

表2 HP4-SBE3-β-CD对麻醉犬呼吸的影响(n=6)Tab 2 Effects of HP4-SBE3-β -CD on the respiratory system of anesthetical dogs(n=6，)

表2 HP4-SBE3-β-CD对麻醉犬呼吸的影响(n=6)Tab 2 Effects of HP4-SBE3-β -CD on the respiratory system of anesthetical dogs(n=6，)

与对照组比较，a P ＞0．05;与用药前比较，b P ＞0．05

组 别 用药前呼吸频率/次·min－1 用药后不同时间呼吸频率/次·min－1 30 min 60 min 120 min 180 min对照组 17．8 ±5．60 16．7 ±6．09 18．3 ±5．85 19．5 ±5．92 20．0 ±5．25 HP4-SBE3-β -CD 组40 mg·kg－1 19．5 ±3．67 20．5 ±5．17ab 20．7 ±3．72ab 19．3 ±4．23ab 20．0 ±5．25ab 80 mg·kg－1 18．5 ±6．41 20．3 ±5．50ab 19．7 ±6．05ab 19．8 ±6．99ab 21．3 ±7．94ab 160 mg·kg－1 18．0 ±4．24 19．0 ±3．46ab 19．7 ±2．73ab 20．8 ±3．81ab 20．3 ±2．94ab组 别 用药前呼吸幅度/mm 用药后不同时间呼吸幅度/mm 30 min 60 min 120 min 180 min对照组 14．2 ±1．33 14．8 ±0．76 13．5 ±0．84 13．2 ±1．47 14．0 ±1．09 HP4-SBE3-β -CD 组40 mg·kg－1 13．3 ±1．50 14．8 ±1．83ab 14．8 ±2．04ab 14．3 ±1．21ab 14．7 ±2．06ab 80 mg·kg－1 13．54 ±1．76 14．5 ±1．76ab 14．3 ±1．86ab 14．8 ±1．16ab 15．0 ±1．90ab 160 mg·kg－1 13．5 ±2．73 14．2 ±2．32ab 13．8 ±1．94ab 14．0 ±1．90ab 14．2 ±2．14ab

2．4．2 对心血管系统的影响 分别静脉注射给予40、80、160 mg·kg－1HP4-SBE3-β -CD 后，各时间点麻醉犬的心电、心率和血压与对照组比较差异无统计学意义(P＞0．05)，用药后与用药前比较差异也无统计学意义(P＞0．05)，表明 HP4-SBE3-β-CD 对麻醉犬心血管系统无明显影响。见表3～5。

表3 HP4-SBE3-β-CD对麻醉犬心电图的影响(n=6，x±s)Tab 3 Effects of HP4-SBE3-β -CD on ECG of anesthetical dogs(n=6，)

表3 HP4-SBE3-β-CD对麻醉犬心电图的影响(n=6，x±s)Tab 3 Effects of HP4-SBE3-β -CD on ECG of anesthetical dogs(n=6，)

与对照组比较，a P ＞0．05;与用药前比较，b P ＞0．05

组 别 用药前P-R/s 用药后不同时间P-R/s 30 min 60 min 120 min 180 min对照组 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01 HP4-SBE3-β -CD 组40 mg·kg－1 0．105 ±0．01 0．105 ±0．01ab 0．105 ±0．01ab 0．105 ±0．01ab 0．105 ±0．01ab 80 mg·kg－1 0．102 ±0．007 0．102 ±0．007ab 0．102 ±0．007ab 0．102 ±0．007ab 0．102 ±0．007ab 160 mg·kg－1 0．104 ±0．008 0．104 ±0．008ab 0．104 ±0．008ab 0．104 ±0．008ab 0．104 ±0．008ab组 别 用药前QRS/s 用药后不同时间QRS/s 30 min 60 min 120 min 180 min对照组 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003 HP4-SBE3-β -CD 组40 mg·kg－1 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 80 mg·kg－1 0．044 ±0．003 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 0．044 ±0．003ab 160 mg·kg－1 0．045 ±0．003 0．045 ±0．003ab 0．045 ±0．003ab 0．045 ±0．003ab 0．045 ±0．003ab组 别 用药前Q-T/s 用药后不同时间Q-T/s 30 min 60 min 120 min 180 min对照组 0．206 ±0．017 0．206 ±0．017 0．206 ±0．017 0．206 ±0．017 0．206 ±0．017 HP4-SBE3-β -CD 组40 mg·kg－1 0．210 ±0．019 0．211 ±0．019ab 0．210 ±0．019ab 0．210 ±0．019ab 0．211 ±0．019ab 80 mg·kg－1 0．208 ±0．012 0．205 ±0．016ab 0．206 ±0．015ab 0．207 ±0．013ab 0．207 ±0．013ab 160 mg·kg－1 0．208 ±0．016 0．207 ±0．017ab 0．207 ±0．017ab 0．208 ±0．016ab 0．208 ±0．016ab

表4 HP4-SBE3-β-CD对麻醉犬心率的影响(n=6，)Tab 4 Effects of HP4-SBE3-β -CD on heart rate of anesthetical dogs(n=6，x±s) 次·min－1

表4 HP4-SBE3-β-CD对麻醉犬心率的影响(n=6，)Tab 4 Effects of HP4-SBE3-β -CD on heart rate of anesthetical dogs(n=6，x±s) 次·min－1

与对照组比较，a P ＞0．05;与用药前比较，b P ＞0．05

用药后不同时间心率组．2 190．0 ±18．8 HP4-SBE3-β -CD 组40 mg·kg－1 188．8 ±18．2 188．2 ±19．2ab 189．3 ±22．6ab 188．5 ±23．2ab 190．0 ±19．1ab 80 mg·kg－1 187．5 ±18．5 194．5 ±18．9ab 198．3 ±18．9ab 195．8 ±18．8ab 197．8 ±18．7ab 160 mg·kg－1 185．3 ±22．1 187．3 ±23．8ab 188．5 ±21．4ab 190．7 ±19．2ab 188．8 ±18．0 30 min 60 min 120 min 180 min对照组 187．3 ±10．6 185．72 ±14．9 191．3 ±20．2 192．7 ±18别用药前心率ab

表5 HP4-SBE3-β-CD对麻醉犬血压的影响(n=6，x±s)Tab 5 Effects of HP4-SBE3-β -CD on blood pressure of anesthetical dogs(n=6，) mmHg

表5 HP4-SBE3-β-CD对麻醉犬血压的影响(n=6，x±s)Tab 5 Effects of HP4-SBE3-β -CD on blood pressure of anesthetical dogs(n=6，) mmHg

与对照组比较，a P ＞0．05;与用药前比较，b P ＞0．05注:1 mmHg=0．133 kPa

用药后不同时间收缩压30 min 60 min 120 min 180 min对照组 145．5 ±15．6 144．0 ±13．8 144．7 ±18．2 144．0 ±19．2 144．0 ±18．3 HP4-SBE3-β -CD 组40 mg·kg－1 148．3 ±15．0 147．5 ±15．8ab 145．8 ±16．3ab 147．2 ±18．6ab 147．7 ±20．2ab 80 mg·kg－1 144．7 ±15．5 148．0 ±15．5ab 150．3 ±15．9ab 149．7 ±14．9ab 148．7 ±13．4ab 160 mg·kg－1 146．0 ±14．8 144．3 ±17．2ab 148．0 ±13．3ab 149．5 ±13．2ab 149．3 ±12．8ab组 别 用药前舒张压 用药后不同时间舒张压30 min 60 min 120 min 180 min对照组 104．8 ±10．6 102．5 ±11．7 103．7 ±13．0 101．8 ±14．4 102．5 ±14．1 HP4-SBE3-β -CD 组40 mg·kg－1 104．0 ±9．4 103．3 ±11．1ab 101．8 ±12．7ab 101．8 ±11．8ab 100．2 ±15．1ab 80 mg·kg－1 103．0 ±10．6 103．3 ±10．6ab 105．5 ±12．2ab 104．7 ±9．4ab 104．7 ±10．2ab 160 mg·kg－1 101．5 ±9．3 99．3 ±11．7ab 100．0 ±9．0ab 103．7 ±9．8ab 102．3 ±10．4ab组 别 用药前收缩压用药后不同时间平均动脉压30 min 60 min 120 min 180 min对照组 121．3 ±12．7 117．8 ±11．3 119．5 ±16．4 118．2 ±17．4 119．2 ±17．2 HP4-SBE3-β -CD 组40 mg·kg－1 120．5 ±11．5 120．3 ±12．6ab 119．0 ±14．1ab 119．2 ±15．0ab 115．3 ±14．5ab 80 mg·kg－1 119．2 ±11．2 120．5 ±12．7ab 122．2 ±13．6ab 120．7 ±12．3ab 121．3 ±11．4ab 160 mg·kg－1 119．0 ±11．8 116．2 ±12．8ab 117．8 ±11．1ab 119．2 ±11．3ab 119．7 ±11．4ab组 别 用药前平均动脉压

3 讨 论

环糊精作为药用辅料应用越来越广泛，非肠道应用其安全性是首要考虑的因素。目前研究比较多的是HP-β-CD和 SBE-β-CD，两者的安全性比其他 CDD要可靠。

很多报道［10－14］认为，环糊精特别是甲基化环糊精的毒性来自于其能溶解细胞膜上磷脂、胆固醇等分子，引起细胞膜成分耗竭，以致细胞死亡，而且溶血程度与溶解胆固醇程度相一致［15］。HPn-SBEm-β-CD引入了羟丙基和磺丁基两种基团，二者是能够有效降低母体环糊精溶血作用的亲水性基团，本研究结果显示，各种取代物的溶血性都低于β-CD，也低于常用的药物赋形剂 HP-β -CD，部分取代物(HP2-SBE3-β -CD、HP1-SBE4-β -CD、HP3-SBE6-β -CD)溶血性低于 SBE7-β -CD。结果表明溶血性与羟丙基和磺丁基取代度直接相关:当磺丁基的取代度≤2时表现出较大的溶血性;当磺丁基的取代度≥2．5时，溶血性显著降低;当总取代度为4～7，其中磺丁基取代度为3～3．5时溶血性最低。同时扫描电镜结果显示，HP3-SBE2-β-CD对红细胞形态影响明显低于M-β-CD，说明HPn-SBEm-β-CD耗竭细胞膜成分的能力弱，对细胞膜毒性小。

本研究结果表明，HPn-SBEm-β-CD对受试动物呼吸系统和心血管系统无影响，显示样品无活性。本实验的HPn-SBEm-β-CD具有适度的平均分子质量，如总取代度=5且溶血作用显著低于HP5-β-CD的HP1-SBE4-β -CD、HP2-SBE3-β -CD 和 HP3-SBE2-β -CD的平均分子量范围为1 571～1 730，远低于SBE7-β-CD的2 089～2 264平均分子量。这对控制制剂中赋形剂使用量有重要而实际的意义。综上所述，本实验的HPn-SBEm-β-CD毒性低，具有极好的应用前景。

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