雌激素受体α基因PvuⅡ和XbaⅠ多态性与子痫前期相关性研究

汤琳琳，徐友娣，薛鑫源，韩云

(南京医科大学附属南京第一医院妇产科，江苏南京 210006)

子痫前期(preeclampsia，PE)是危及母婴健康的妊娠期特发性疾病，其发病机制至今尚未阐明。血管内皮损伤是目前公认的PE一系列病理生理反应的基础。而雌激素为天然的血管保护剂，能改善内皮细胞功能，抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移，降低血脂，改善血流动力学参数，起到扩血管、抗炎、抗增生等血管保护作用［1］。在人体内，雌激素通过与其特异性受体——雌激素受体(estrogen receptor，ER)结合来调节一系列基因的表达，进而发挥其重要生理作用。研究已发现，ER基因多态性与冠心病密切相关［2］，而 PE亦有血管内皮损伤这一基本过程，因此提出，ER基因多态性与PE具有密切的关系。既往ER的研究大部分集中在 ERα的遗传多态性方面［2－3］，本研究亦选择ERα基因。通过从全血中提取DNA，运用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测PE患者与健康孕妇在ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ两个酶切位点的多态性，探讨PE的发生与ER基因多态性之间的关系及不同病变程度的PE与其多态性之间的关系，为今后进一步研究PE的发病机制奠定基础，也为今后临床上的早期诊断、干预性治疗和寻找药物作用靶点阐明理由。

1 资料与方法

1． 1 临床资料

按文献［4］标准，选取2008年7月至2010年2月在我院产科住院的135例诊断为PE的患者为研究对象(PE组)，组内进一步分为轻度PE组(n=64)和重度PE组(n=71);选取同期住院的122例年龄、孕周与实验组均无统计学差异的正常孕妇为对照组。所有孕妇均为初产妇，无其他合并症和慢性病史，研究对象符合Hardy-Weinbery平衡定律。

1． 2 研究方法

1．2．1 DNA提取 取全血3 ml，选用美国OMEGA公司提供的全血DNA试剂盒，提取基因组DNA后，置－80℃保存备用。

1．2．2 PCR检测 限制性内切酶 PvuⅡ和 XbaⅠ酶切位点相近，XbaⅠ与P位点相距50 bp。本实验ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠPCR扩增产物为同一段包括第1内含子和部分第2外显子，长度1．3 kb的DNA片断。PCR引物设计如下:上游引物序列为5'-CTGCCACCCT ATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC-3'，下游引物序列为5'-TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA-3'，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。总反应体系50 μl，组成如下:PCR Master Mix(2 × )25 μl，上游引物 1．0 μl，下游引物 1．0 μl，模板 DNA 3．0 μl，灭菌水20 μl。混匀后按下列循环扩增:94℃预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 90 s，72 ℃保温延伸10 min，共35个循环。取PCR产物10 μl在1．5%琼脂糖凝胶上电泳35 min，经溴化乙锭染色及凝胶系统成像后观察特异性条带，为1 300 bp。

1．2．3 RFLP检测 ERα基因PCR产物分别与限制性内切酶PvuⅡ及XbaⅠ混合，水浴37℃过夜。成分如下:PCR 产物 10 μl，PvuⅡ或 XbaⅠ1．0 μl，10 × buffer G 2．0 μl，灭菌双蒸馏水 17 μl。取各自酶切产物行经溴化乙锭染色的1．5%琼脂糖凝胶电泳。

ERα基因的PCR扩增产物为1．3 kb，经PvuⅡ限制酶水解后可得到3种基因型(含PvuⅡ酶切位点的等位基因记为“p”，无酶切位点的记为“P”)，即pp型(850 bp+450 bp)、Pp型(1 300 bp+850 bp+450 bp)、PP型(1 300 bp)。同样，ERα基因的PCR扩增产物经XbaⅠ限制性内切酶水解后可得到3种基因型:xx型(900 bp+400 bp);Xx型(1300 bp+900 bp+400 bp);XX型(1300 bp)。

1． 3 统计学处理

研究数据均采用SPSS 13．0统计软件进行分析，基因型和等位基因频率采用基因计数法计算，基本资料以x±s表示，采用t检验，两组基因型分布频率及等位基因表型频率的比较，采用R×C列联表和四格表χ2检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2． 1 临床资料比较

见表1。

表1 PE组及对照组的基本资料

PE组和对照组之间及PE组组内孕妇年龄、孕周比较差异无统计学意义。PE组与对照组之间的收缩压和舒张压均差异有统计学意义(P＜0．05)，PE组内轻度PE收缩压、舒张压及24 h尿蛋白显著低于重度PE(P ＜0．05)。

2． 2 ERα基因PvuⅡ及XbaⅠ酶切结果

见图1。

图1 ER α基因多态性PvuⅡ及XbaⅠ酶切电泳图

2． 3 PE组与对照组ERα-PvuⅡ的基因多态性

见表2、3。

由表2可见，PE组与对照组之间ERα-PvuⅡ基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=5．117，P=0．077)，而等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=4．756，P=0．029)。由表3 可见，PE 组组内轻度PE与重度PE的ERα-PvuⅡ基因型及等位基因频率差异均无统计学意义(χ2=1．644，P=0．440;χ2=0．442，P=0．506)。

2． 4 PE组与对照组ERα-XbaⅠ的基因多态性

见表4、5。

由表4、5可见，PE组与对照组之间及轻度PE与重度PE的ERα-XbaⅠ基因型及等位基因频率分布差异均无统计学意义(P＞0．05)。

3 讨 论

国内外关于ERα基因PvuⅡ及XbaⅠ多态性与妊娠期高血压或PE关系的研究结果各一。早期向若兰等［5］研究发现，妊娠期高血压疾病组PP基因频率、P等位基因频率明显高于对照组(P＜0．01);妊娠期高血压疾病组与其对照组X和x等位基因频率分布差异有统计学意义(P＜0．01)。ER的PvuⅡ及XbaⅠ基因多态性与妊娠期高血压疾病相关，二者都是其发病的独立危险因素，PvuⅡ基因多态性与妊高征的相关程度较强，XbaⅠ基因多态性与妊娠期高血压疾病的相关程度较弱。德国Tempfer等［6］的一个小样本多基因病例对照研究结果表明，ERα基因PvuⅡ多态性并非重度PE的独立危险因素，但可能参与构成重度PE的多基因发病机制。Molvarec等［7］研究发现，重度PE与雌激素受体α基因PvuⅡ及XbaⅠ的多态性均无相关性。Zhang等［8］研究结果亦表明，PE组与对照组之间雌激素受体α基因PvuⅡ或者XbaⅠ在基因型和等位基因频率分布之间无明显相关性，且轻度PE和重度PE之间亦无明显相关性。

表2 PE组与对照组ERα-PvuⅡ的基因多态性统计结果

表3 PE组内ERα-PvuⅡ的基因多态性统计结果

表4 PE组与对照组ERα-XbaⅠ的基因多态性统计结果

表5 轻度PE与重度PE组间的ERα-XbaⅠ基因多态性统计结果

本研究通过对南京地区135例的PE患者(其中64例为轻度，71例为重度)与122例正常孕妇进行研究，发现ERα基因PvuⅡ酶切位点多态性与PE的发生存在一定的相关性，P等位基因可能是其危险因素，但与PE的病变程度无明显关联。ERα基因XbaⅠ酶切位点的基因多态性与PE的发生及其病变程度均无明显相关。

雌激素必须与靶组织细胞浆或核内ER结合才能发挥作用。因此，雌激素受体的结构和功能直接影响到雌激素的作用效果。根据本研究结果，推测ERα基因P等位基因的出现改变了ERα的表型，从而降低了雌激素与其结合后的效用，故血管内皮易受损伤，易致PE的发生。而PE的病变程度则由其他因素决定，如血管活性物质等。

ERα基因多态性与PE相关性的研究结果目前国内外有较大的差异，甚至完全相反。考虑可能与人群、种族、地域或样本量有关，也可能某些基因虽未发生突变，但其基因活性的改变与发病相关，同时PE是一种多因素疾病，属遗传易感性疾病，是遗传因素与环境因素共同作用的结果。探求PE的发病原因以及将研究成果应用于临床以筛选PE高危人群，需要更大规模的、多方面的、多地域的、多民族的流行病学和进一步的实验室研究。

［1］GRUBER C J，TSCHUGGUEL W，SCHNEEBERGER C，et al．Production and actions of estrogens［J］．N Engl J Med，2002，346(5):340-352．

［2］金莉子，肖宏凯，陈剑，等．雌激素受体α基因多态性与冠心病病变程度的关系［J］．中国动脉硬化杂志，2008，16(8):647-650．

［3］van DIJK M A，FLOORE A N，KLOPPENBORG K I，et al．A functional assay in yeast for the human estrogen receptor displays wild-type and variant estrogen receptor messenger RNAs present in breast carcinoma［J］．Cancer Res，1997，57(16):3478-3485．

［4］乐杰．妇产科学［M］．6版．北京:人民卫生出版社，2006:97．

［5］向若兰，王琳，王毅，等．妊娠高血压综合征和雌激素受体基因血管紧张素转化酶基因相关性研究［J］．当代医学，2001，7(11):78-82．

［6］TEMPFER C B，JIRECEK S，RIENER E K，et al．Polymorphisms of thrombophilic and vasoactive genes and severe preeclampsia:a pilot study［J］．J Soc Gynecol Investig，2004，11(4):227-231．

［7］MOLVAREC A，VÉR A，FEKETE A，et al．Association between estrogen receptor alpha(ESR1)gene polymorphisms and severe preeclampsia［J］．Hypertens Res，2007，30(3):205-211．

［8］ZHANG J，BAI H，LIU X，et al．Genotype distribution of estrogen receptor a polymorphisms in pregnant women from healthy and preeclampsia populations and its relation to blood pressure levels［J］．Clin Chem Lab Med，2009，47(4):391-397．