精制狗皮膏挥发性成分的提取及其GC-MS分析

颜巧蓉 唐宇航 刘文涵

（浙江工业大学化学工程与材料学院，浙江 杭州 310014）

中成药精制狗皮膏具有舒筋、活血、散寒、止痛的功效，用于治疗筋骨痛、急性挫伤、扭伤、风湿痛、关节痛、胁痛、肌肉酸痛等症。主要由生川乌、防己、山柰、透骨草、延胡索、干姜、辣椒、樟脑、冰片等十二味中药制备而成［1］。其中山柰、透骨草、干姜、樟脑、冰片等含有挥发性成分，这些挥发性成分具有一定的药理和药效，是质量评价的重要指标［2］。

目前，精制狗皮膏的质量控制中只有粉防己碱、延胡索的薄层色谱鉴别和含膏量检查［1］，仅就这两项指标控制该产品的质量未免有失全面。本文采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对精制狗皮膏进行了挥发性成分分析，为有效控制产品的质量提供理论依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

精制狗皮膏（国内某品牌，批号：100501，购于杭州药店）。

GC6890N/MSD5973N气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）；TC-15型恒温电热套（海宁市华星仪器厂）；AL204型电子天平（Mettler-Toledo Group）；挥发油提取器（油比水轻型）。

乙酸乙酯、丙酮、乙醚、二氯甲烷、正己烷、无水硫酸钠均为分析纯；水为超纯水（电阻率≥18.3MΩ·cm，自制）。

1.2 供试品溶液的制备

取样品2贴，除去盖衬，剪成小碎片，置500mL圆底烧瓶中，加入200mL超纯水和数粒玻璃珠，室温浸泡0.5h，接妥挥发油提取器，由其上端加入超纯水至溢流入圆底烧瓶为止，加入1mL乙酸乙酯。置电热套中缓缓加热至沸开始计时，并保持微沸4h。停止加热，静置冷却，取乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥后置于容量瓶中，并用适量溶剂洗涤挥发油测定器数次，洗涤液并入容量瓶中，用溶剂定容，摇匀。过0.45μm膜，供GC-MS分析。

1.3 GC-MS分析条件

色谱条件：HP-5MS色谱柱（30m×0.25mm，0.25μm）；载气：高纯氦（99.999％），流速：0.8mL·min-1（恒流）；进样口温度：250℃；程序升温：初温50℃，保持5min，然后以5℃·min-1升至260℃，保持10min；进样量：1μL；分流比：20：1。

质谱条件：离子源：EI源；电子轰击能量：70e V；倍增电压：1 294V；离子源温度：230℃；接口温度：280℃；质量扫描范围：45amu～500amu；溶剂延迟：4.5min。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法研究

2.1.1 浸泡时间的考察

不同的浸泡时间对中药提取度的影响不同。本次实验分别考察了浸泡0.5h和3h的效果，结果发现浸泡时间对挥发油提取率及成分基本无影响。考虑到实验操作过程中的实际性，选择浸泡时间为0.5h。

2.1.2 萃取溶剂的选择

在前处理中，选用不同的溶剂作为萃取蒸馏液溶剂时得到的结果差别比较大。本实验分别考察了丙酮、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、正己烷这5种溶剂，发现用乙醚和正己烷作为萃取溶剂时得到的TIC峰的数目较其它三种萃取溶剂多。而用乙醚和正己烷这两种溶剂萃取出的组分色谱图在色谱峰的个数和含量上差别不大；考虑到乙醚的挥发性较正己烷强，在提取过程中以及提取物的保存中都不如正己烷溶剂稳定，所以本文选择正己烷作为萃取溶剂。

2.1.3 单次加水量的确定

为考察单次加水量对挥发油得率的影响情况，固定其它条件不变，改变单次加水量。随着加水量的增加，峰响应值先增加后减少，单次加水量为200mL时响应值最高。因此，在后面的提取实验中选择加200mL超纯水。

2.1.4 提取时间的优化

实验过程中，提取时间是比较关键的影响因素之一，本文考察了提取时间分别为1h、2h、3h、4h、5h和6h的试验情况。结果表明：在0～4h内响应值随着提取时间的延长而增加，4h后响应值略有上升但幅度不大，为了节约时间，提高工作效率，选择4h为最佳提取时间。

2.1.5 重现性实验

为进一步验证实验结果的可靠性与重复性，在以上确定的条件下做3次实验，3次实验TIC峰的数目相同且强度也相差很小，说明在此条件下实验重现性较好。

2.2 精制狗皮膏挥发性成分分析

在优化的实验条件下，提取精制狗皮膏中的挥发性成分并进行GC-MS分析，所得总离子流图（TIC）见图1。

图1 精制狗皮膏挥发性成分总离子流图Fig 1 Total ion chromatography of volatile components from Refining Cream dogskin

通过检索NIST 2005谱图库，并查阅有关文献［3-10］与标准谱图库对照分析，确认精制狗皮膏挥发性组分的化学成分。共检出76个色谱峰，鉴定了其中59个化合物，占总峰面积的92.70％。采用峰面积归一化法求得各组分在挥发油中的相对百分含量，结果见表1。

表1 精制狗皮膏挥发性化学成分Tab 1 Chemical components of volatile compounds from Refining Cream dogskin

续表1

由表1可知，精制狗皮膏的主要成分为樟脑（36.35％）、薄荷脑（21.43％）和水杨酸甲酯（15.95％），其中相对百分含量超过1％的还有长叶烯（7.94％）、右松酯醛（2.71％）、石竹烯（1.77％）和西柏烯（1.24％），上述成分占挥发油总量的87.39％。从化合物种类来看，主要为萜烯类及其含氧衍生物（41种，75.66％）、芳香族类（5种，16.68％）和烷烃类（12种，0.36％）化合物。萜类化合物中含单萜类12种，倍半萜类23种，二萜类6种，这些萜类化合物具有抗炎、止痛、消肿等多种功效，这与精制狗皮膏的药效基本一致。

3 结论

本文通过单因素试验对精制狗皮膏挥发性成分提取过程中的多种因素进行了优化，确定最佳提取条件为：室温下超纯水浸泡0.5h，单次加水量200mL，水蒸气蒸馏提取4h，萃取溶剂选用正己烷。采用GC-MS法对提取的挥发性成分进行了分离和鉴定，共分离出76个组分，并鉴定了其中59个化合物，主要为单萜烯类、倍半萜烯类及其含氧衍生物。此研究结果可为精制狗皮膏气相色谱指纹图谱的研究及其质量控制提供依据。

［1］中华人民共和国卫生部药品标准［S］.中药成方制.第八册，1993：203.

［2］梁 悦，王 璐，茹 鑫，等.逍遥丸（水丸）挥发性成分的提取及其气相色谱-质谱法分析［J］.分析测试学报，2009，28（10）：1170.

［3］Wang Z M，Wang L，Li T C，et al.Rapid analysis of the essential oils from dried Illicium verum Hook.f.and Zingiber officinale Rosc.by improved solvent-free microwave extraction with three types of microwave-absorption medium［J］.Anal Bioanal Chem，2006，386（6）：1867.

［4］李 翔，王 敏.干姜挥发油的均匀设计提取和化学成分鉴定［J］.华北国防医药，2010，22（3）：218.

［5］容 蓉，邱丽丽，刘 朋，等.干姜挥发性成分的水蒸气蒸馏提取与顶空进样气相色谱-质谱分析［J］.时珍国医国药，2010，21（11）：2811.

［6］邱 琴，刘廷礼，赵 怡，等.气相色谱-质谱法分析山柰挥发油化学成分［J］.理化检验-化学分册，2000，36（7）：295.

［7］崔炳权，郭晓玲，林元藻.海南产山柰挥发油化学成分分析［J］.中国药房，2008，19（3）：216.

［8］张桂芝，顾玲燕，孟庆华.山柰饮片挥发油的GC-MS特征成分和指纹图谱研究［J］.中成药，2009，31（7）：987.

［9］侯冬岩，回瑞华，李铁纯.GC/MS法分析透骨草化学成分［J］.辽宁师范大学学报（自然科学版），2002，25（3）：292.

［10］杨再波，钟才宁，孙成斌，等.固相微萃取/GC-MS分析透骨草的挥发性成分［J］.华西药学杂志，2008，23（4）：389-390.