毛细管气相色谱法测定金钱草茎叶中多糖的单糖组成

刘俊劭 江慧华 林志銮 陈培珍

（福建省高校绿色化工技术重点实验室，武夷学院环境与建筑工程系，福建 武夷山 354300）

毛细管气相色谱法测定金钱草茎叶中多糖的单糖组成

刘俊劭 江慧华 林志銮 陈培珍

（福建省高校绿色化工技术重点实验室，武夷学院环境与建筑工程系，福建 武夷山 354300）

金钱草多糖经三氟乙酸水解、后利用二甲基亚砜（DMSO）作溶剂，六甲基二硅胺烷（TMDS）和三甲基氯硅烷（TMCS）作硅烷化试剂，将单糖衍生化为三甲基硅醚衍生物，用气相色谱（GC）分析法测定金钱草叶和根茎中多糖的单糖组成。结果表明：金钱草叶和根茎中多糖都是由甘露糖、果糖、核糖、半乳糖、鼠李糖和树胶醛糖单糖组成，其摩尔比分别为1.40:1.00:1.00:4.68:0.98:0.46和1.03:1.00:1.04:1.66:0.56:0.44。

金钱草;单糖;毛细管气相色谱法

多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，是一类分子结构复杂且庞大的糖类物质。广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中，近年来研究发现多糖类化合物具有抗肿瘤和增强免疫作用的功效，引起医学界极大的重视。金钱草为报春花科（Primulaceae）珍珠菜属，在我国分布广泛。金钱草味苦、酸、微寒，功能清热解毒、利尿排石、活血散瘀，用于治疗肝胆结石，胆囊炎，黄疸性肝炎，水肿，跌打损伤，毒蛇咬伤，毒蕈及药物中毒，化脓性炎症烧烫伤等症[1-3]。据研究报道，金钱草的多糖具有除刺激免疫器官增重和淋巴细胞增加的功能，说明金钱草多糖可能具有的抗肿瘤作用[4]。

本研究通过金钱草的多糖水解，衍生化后，进行气相色谱GC分析，研究其单糖的组成及含量，为进一步研究其药理活性和机制提供物质基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试剂及原材料

所用的标准单糖：葡萄糖、D-核糖、L-树胶醛糖、D-果糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖、鼠李糖，均为国药集团化学试剂有限公司产品；浓硫酸、苯酚、石油醚、无水乙醇、氯仿、三氟乙酸、三甲基氯硅烷、六甲基二硅胺烷、二甲基亚砜等试剂均为AR；金钱草来自武夷山地区，经武夷学院绿色化工技术重点实验室贾剑晖实验师鉴定。

1.1.2 主要仪器

岛津GC－14C气相色谱仪；岛津AA-6300F紫外可见分光光度计

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理方法

1、提取 称取粉碎的金钱草干叶和干茎分别用石油醚回流2小时，除去溶剂，再用80%乙醇回流提取2小时，以除去脂类物质，然后除去醇液，水煎1.5h重复3次，取水煎液浓缩，用氯仿萃取，水层中多糖用乙醇洗脱，过滤乙醇，沉淀物用丙酮和无水乙醇反复洗涤以去除鞣质，烘干，再用超纯水溶解，用微孔滤纸抽滤后于旋转蒸发仪里浓缩，取浓缩液烘干。

2、sevage法脱蛋白 金钱草多糖脱蛋白参考文献[5]

3、干燥称量计算粗多糖的提取率。

1.2.2 苯酚-硫酸法测定多糖含量[6,7]

准确称取标准葡萄糖10.3mg于250 ml容量瓶中，加水至到刻度，分别吸取 0.4mL，0.6mL，0.8mL，1.0 mL，1.2mL，1.4mL，1.6mL 及 1.8mL，各以蒸馏水补至2.0mL，然后加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL，静止10分钟，摇匀，室温放置20分钟后，于490 nm测吸光度，以2.0mL蒸馏水按同样显色操作为空白，以横坐标为多糖微克数，纵坐标为吸光度值。葡萄糖标准曲线见图1。

图1 以葡萄糖为标准溶液的总糖测定曲线Fig1 The standard curve of glucose

准确称量金钱草叶多糖和根茎多糖于250ml容量瓶中，加水至到刻度，按上述步聚配置溶液，分别以同样的方法进行测吸光度值。测定粗多糖中多糖的含量。

1.2.3 衍生化法测定单糖

1、标准单糖衍生化 准确称取D-核糖、L-树胶醛糖、D-果糖、D-甘露糖、D-木糖、D-半乳糖、鼠李糖、肌醇各300mg，溶解后，转移于100mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，制得标准溶液。用移液管准确移取标准溶液2mL，在80℃水浴中真空蒸干。在蒸干的标准样中加入2mL的二甲基亚砜（DMSO），在超声波中振荡使之溶解。溶解后加入2mL的六甲基二硅胺烷（HMDS）和 1mL 的三甲基氯硅烷（TMCS），进行衍生化。分离上层液，过滤供气相色谱分析。

2、样品的水解 称取金钱草茎多糖和金钱草叶多糖各一份，分别置于水解管中，溶解在5mL的2M的三氟乙酸（TFA）溶液中，100℃氮气保护下水解4h，减压浓缩至干。

3、样品的衍生化 分别取金钱草根茎和叶的水解样加入内标物肌醇，然后用2mL的二甲基亚砜（DMSO），在超声波中振荡使之溶解。溶解后加入2mL的六甲基二硅胺烷（HMDS）和1mL的三甲基氯硅烷（TMCS），进行衍生化。衍生化后单糖转变为三甲基硅醚衍生物。分离上层液，过滤供气相色谱分析。

2 结果与分析

2.1 金钱草多糖的含量

经过浸泡、热提、醇析等方法提取金钱草中的多糖成分，沉淀除蛋白质后，采用硫酸苯酚法测定其多糖含量，结果见表1。

表1 金钱草多糖的提取率Table 1 The extraction rate of polysaccharide

2.2 金钱草单糖的测定

2.2.1 气相色谱条件

色谱柱：毛细管柱 CBP1-M25-0.25，25m×0.25μm，氢火焰离子化检测器，载气 N2，流速30 mL/min，进样量0.1μL，进样温度230℃，FID检测器温度230℃，柱温度 195℃。

2.2.2 定性定量分析

按上述色谱条件分别对标准溶液、叶和根茎样品溶液进行测定，以标准品定性，内标法定量，标准混合单糖、叶多糖和根茎多糖的色谱图分别见图2、图3、图4。

图2 标准单糖衍生化产物的GC分析Fig.2 Gas chromatogram of standard sugar

图3 金钱草根茎单糖气相色谱图Fig.3 Gas chromatogram of the monosaccharide of rhizome

图4 金钱草叶单糖气相色谱图Fig.4 Gas chromatogram of the monosaccharide of leaf

2.3 讨论

由于单糖本身没有足够的挥发性，必须预先转化成易挥发、对热较稳定的衍生物才能采用气相色谱进行分析。由于单糖的异构化，在衍生化制备过程中，易产生衍生物的异构体，为此，一种单糖得到的往往不是出一个色谱峰[8,9]。单糖的定性是用各种单糖的标准样品衍生化后，用气相色谱分别测定每种单糖的色谱峰和保留时间，由此定性分析金钱草样品中单糖的种数。单糖含量的定量计算，采用内标法计算，本文以肌醇为内标物。

3 结论

（1）金钱草叶多糖的提取率高于根茎的提取率。金钱草叶多糖总提取率为2.40%（干品），根茎多糖总提取率为1.66%（干品）。

（2）金钱草的根茎和叶都含有甘露糖、果糖、核糖、半乳糖、鼠李糖和树胶醛糖，其中含量最多的是半乳糖，根茎和叶各种单糖比例为甘露糖：果糖：核糖：半乳糖：鼠李糖：树胶醛糖为 1.03：1.00：1.04：1.66：0.56：0.44 和 1.40：1.00：1.00：4.68：0.98：0.46。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 [M].北京:化学工业出版社,2000年版一部：176.

[2]刘隽,邹国林.金钱草的研究进展 [J].唐山师范学院学报,2002,24(002):8-10.

[3]张兆瑞,张屹立,张光早,等.金钱草应用浅析 [J].丹东医药,2005,003):39-40.

[4]赵武述,张玉琴,赵世琴.黄芪脂多糖,金钱草多糖和山茱萸糖促进免疫作用的研究[J].中日友好医院学报,1989,3(4):194-198.

[5]穆文静,杜玲,扈瑞平,等.钝顶螺旋藻多糖 Sevage法脱蛋白工艺的研究[J].内蒙古石油化工,2011,10):1-4.

[6]林志銮,刘俊劭.3,5-二硝基水杨酸法测定金钱草多糖的研究[J].云南民族大学学报:自然科学版,2011,20(2):89-91.

[7]刘俊劭,林志銮.两种分光光度法测定金钱草中多糖含量的研究[J].洛阳师范学院学报,2011,30(002):48-50.

[8]姜波,关紫烽,白松涛,等.采用 GC法分析苦丁茶中可溶性单糖的研究[J].茶叶科学,2006,26(3):195-198.

[9]张惟杰主编.复合多糖生化研究技术 [M].上海：上海科学技术出版社,1987.

Determination of Monose in the Stems and Leaves of Lysimachia Christinae Hance by Capillary Chromatograph

LIU Junshao JIANG Huihua LIN Zhiluan CHEN Peizhen

(Key Laboratory for Green Chemical Engineering Technology of Fujian Higher Education Department of Environmental and Architectural Engineering，Wuyi University，Fujian 354300)

Polysaccharide of Lysimachia christinae Hance is hydrolyzed by trifluoroacetic acid.The hydrolysate was derived into trimethylsilylethers derivative with hexamethyedisilane(HMDS)and trimethylchlorosilane(TMCS)as silanizing agent,and dimethyl sulfoxide(DMSO)as solvent.The monosaccharide was determined by GC with capillary column.The results showed that the polysaccharide of leaves and stems were composed of mannose,fructose,ribose,galactose,rhamnose and arabinose,and themolar ratio of thosemonose is 1.40:1.00:1.00:4.68:0.98:0.46 and 1.03:1.00:1.04:1.66:0.56:0.44,respectively.

lysimachia christinae hance;monose;capillary chromatograph

R284.1

A

1674－2109(2011)05－0048－04

2011-08-30

武夷学院校科研基金海西项目 （项目编号：xh201002）；武夷学院对接南平产业发展科研专项（项目编号：2011DJ10）

刘俊劭（1971-）男，汉族，讲师，硕士，主要研究方向：天然产物提取和分析。