黄芪组分对乳鼠肥大心肌细胞ATP含量的影响＊

苏敬泽，林 谦，农一兵

(1.北京市宣武区中医医院，北京 100050;2.北京中医药大学东方医院，北京 100078)

循环血中和/或心肌局部血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是引起心肌细胞肥大的最重要活性物质[1～3]，而能量代谢障碍是心肌肥厚和充血性心力衰竭重要的推动因素之一，贯穿在心肌肥厚发生、发展的全过程中，是导致心肌肥厚发展为心衰的重要因素[4]。既往研究表明，黄芪对心衰、缺血缺氧、再灌注损伤和病毒损伤的心肌，具有保护心肌线粒体结构、提高生物氧化相关的多种酶的活性、减少乳酸脱氢酶外漏等作用，从而改善心肌能量代谢[5～7]。我们在血管紧张素Ⅱ致乳鼠心肌细胞肥大模型基础上，选用黄芪注射液(主要成分为黄芪皂苷)和注射用黄芪多糖，观察其对心肌细胞ATP含量的影响，旨在探讨黄芪组分对心肌细胞能量代谢的干预作用，为中药防治心衰提供实验依据。

1 材料

1.1 动物与主要试剂

Wistar大鼠由中国医学科学院实验动物中心提供;血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)，Sigma Inc;络沙坦(losartan)，Merck Research Laboratories;黄芪注射液，成都地奥九泓制药厂，10ml/支(批号0410027);注射用黄芪多糖，美国泛华医药公司，250mg/支(批号8k01101);Trypsin，SigmaInc;CollagenaseⅡ，GibcoInc;Dulbecco’sModified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham，Sigma Inc;胎牛血清(特级)，杭州四季青生物工程材料有限公司;5-Bromo-2’-Deoxyuridind(Brd-u)，Sigma Inc;小鼠α－横纹肌动蛋白单克隆抗体，武汉博士德生物工程有限公司;RNAgents Total RNA Isolation system，Promega;Access Quick RT-PCR System，Promega。

1.2 仪器

P4000高效液相色谱仪，UV6000二级管阵列检测器，ChromQuest分析软件，美国TSP公司Olympus IX71+制冷摄像头倒置荧光显微镜;SHEL-LAB 2323 CO2培养箱;再鑫CLASS 100超净台。

2 方法

2.1 心肌细胞培养与鉴定

利用乳大鼠培养心肌细胞的方法最早由Harary报道[8]，本实验以Harary的方法为基础，同时参考其他研究者的经验，将出生1d～3d的Wistar大鼠(雌雄不拘)在无菌条件下取出心脏，将心脏剪成1mm3大小的组织块，胰酶、胶原酶混合消化液，于37℃水浴振荡分次消化，直至组织块完全消化。收集除第1次以外的细胞悬液，加入胎牛血清终止酶消化。4℃离心弃上清，制成单细胞悬液。然后按差速贴壁分离法孵育1h～1.5h，纯化心肌细胞并计数，依需要密度接种。其中细胞培养液中含有10%胎牛血清、0.1mmol/L的Brd-u及青霉素100 mg/L、链霉素100万U/L。细胞于37℃、5%CO2、95%湿度环境培养，大约每36h～48h换1次液，培养3d～4d后使用。

细胞培养第3天用免疫组织化学方法鉴定心肌细胞，一抗为小鼠α-横纹肌动蛋白单克隆抗体，DAB显色，本抗体对α骨骼肌和α心肌的肌动蛋白具有特异性。

2.2 分组与给药

正常培养3d后换1%血清培养基培养，其他条件不变，实验共分6组:(1)正常对照组:不加任何药物;(2)肥大模型组:10－7mol/L的血管紧张素Ⅱ;(3)络沙坦组:10－7mol/L血管紧张素Ⅱ+10－6mol/L losartan;(4)黄芪皂苷组:10－7mol/L血管紧张素Ⅱ+10－2g/L黄芪注射液;(5)黄芪多糖组:10－7mol/L血管紧张素Ⅱ+10－2g/L黄芪多糖注射液;(6)黄芪皂苷合多糖组:10－7mol/L血管紧张素Ⅱ+10－2g/L黄芪注射液+10－2g/L黄芪多糖注射液.

黄芪注射液及黄芪多糖注射液浓度选择根据既往实验结果[9]，溶剂为DMEM/F12，工作液浓度为终浓度的100倍。

2.3 ATP含量测定(HPLC)

参照Enrique CHACON[10]及党永明[11]的方法并适当改进。以25cm2培养瓶培养心肌细胞，每瓶细胞数约3×106个，正常培养3d～4d后分组实验。按24 h、48 h 2个时点加药，每组每个时点重复做3瓶，求其平均值。

2.3.1 样品制备 冰冷的D-Hanks冲洗细胞2次，弃去平衡液，称培养瓶重量;每瓶加入1ml10%冰冷的高氯酸，将细胞刮入EP管中，立即置于液氮中保存，再次称培养瓶重量，计算重量差值;测定时取出，用超声波细胞破碎仪将细胞膜打碎;4℃10000rpm离心30min，取上清液;加入与2.5mol/L KOH，调PH至6.5，再次4℃10000rpm离心30min;取上清液用0.22μm滤膜过滤即成测定样品。

2.3.2 色谱条件 色谱柱:ODS HYPERSIL C18分析柱(5μm，250mm×4.6mm);柱温:室温25℃;流动相:50mmol/L磷酸钾缓冲液(含0.2%甲醇，pH 6.5)。实验当天用微孔滤膜(0.2μm)抽滤、超声脱气，流速1 ml/min;紫外检测波长254nm;样品进样体积20μl;实验采用外标法定量。

2.3.3 结果判定 样品出峰的保留时间与标准品比较，确定ATP成分并制定标准曲线。根据曲线峰面积及细胞质量计算各组心肌细胞ATP的含量。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 心肌细胞形态及鉴别结果

心肌细胞在培养24h开始伸展，细胞形态不规则，部分细胞聚集成团生长，开始出现收缩运动，3d后细胞有节律的收缩运动，成簇细胞尤为显著。细胞免疫化学证实，99%以上的细胞为阳性染色细胞，只有极个别细胞不着色。证实原代培养的细胞纯度很高，因此用该细胞进行的试验是可靠的。

3.2 黄芪组分对肥大心肌细胞ATP含量的影响

3.2.1 ATP的定性分离 样品出峰的保留时间与标准品相近(图1、2)，心肌细胞样品中加入标准品后出峰增高(图3)，由此可以确定心肌细胞色谱图中ATP的成分。

3.2.2 标准曲线 在选定的分析条件下，按外标定量法，ATP质量浓度为0.25～50.54ug·ml－1，浓度与峰面积有良好的线性关系，回归方程、相关系数为Y=14361X+31357，R2=0.9995(n=8)。

图1 正常样品

图2 标准品

图3 样品+标准品

3.2.3 精密度 日内和日间精密度实验均含低、中、高3种浓度，日内实验各浓度在1d内分别进样5次，日间实验各浓度每天进样1次，连续观测5d。结果表明，日内和日间均可获得较好的重复性，二者相对偏差(RSD)分别在0.4%和2.1%以下。

3.2.4 回收率 在已知浓度的样品中，分别加入低、中、高3种不同浓度的ATP标准品，按样品测试方法测定其加样回收，测得回收率为87.2%～118.5%(n=3)。

3.2.5 黄芪组分对肥大心肌细胞ATP含量的影响 表1显示，24h各组心肌细胞ATP含量无显著性差异;48h模型组ATP含量增加，与正常组比较差异显著;络沙坦组、黄芪皂苷、黄芪多糖及黄芪皂苷多糖组ATP含量也有所增加，其中络沙坦组、黄芪皂苷及黄芪皂苷多糖组与正常组比较差异显著，但各组ATP含量均低于模型组，差异显著。

表1 黄芪组分对肥大心肌细胞ATP含量的影响

表1 黄芪组分对肥大心肌细胞ATP含量的影响

注:1)与模型组比较:P＜0.05;2)与正常组比较:P＜0.05

组别药物终浓度(g/L)ATP含量(ug/g)24h 48h正常对照组 — 48.890±1.506 48.890±1.5061)模 型 组 — 50.250±0.574 64.917±0.7262)洛 沙 坦 组 10－6 49.980±0.986 60.313±0.7721)2)黄芪皂苷组 10－2 48.637±0.117 59.653±0.5901)2)黄芪多糖组 10－2 49.867±0.630 50.113±0.1991)皂苷+多糖组 10－2 49.277±0.609 59.900±0.6361)2)

4 讨论

4.1 ATP是心肌收缩的直接供能物质

心肌代谢能量的来源主要是ATP等高能磷酸键，而线粒体是氧化代谢产生能量的主要细胞器官，它的主要功能是生产、储存ATP。呼吸链及氧化磷酸化的酶类均集合于线粒体内膜上，呼吸链的主要成分还原型烟酰胺二核苷酸(NADH)脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、铁硫蛋白、细胞色素b、c1、c、a、a3等在传递电子的同时，会使线粒体内膜形成质子(H+)跨膜电化学电位差，线粒体合成酶F1－F0复合体就可借此电位差进行ADP磷酸化生成ATP，使ADP磷酸化生成ATP是线粒体最重要的功能之一。线粒体合成酶F1－F0复合体即H+_ATP酶体系的生理功能在于利用膜内电子传递所产生的质子电化学能而合成ATP，其主要由两部分组成，球状的头部与柄是亚单位F1，埋于内膜内的底部则为亚单位F0。F1亚单位由α、β、γ、δ、ε5种多肽链组成。β肽是具有催化活性的部位，γ肽可能是控制质子通过的闸门。实际上，F1亚单位是Ca2+，Mg2+-ATP酶复合物，具有ADP和ATP结合部位，经常有ADP和ATP牢固地结合在其上。一个结合位点上结合的ATP被移向胞质，另一个结合位点的ADP即被磷酸化形成新的ATP，重新占据ATP结合位点。

4.2 心肌肥厚时心肌组织ATP含量下降

心肌肥厚时，心脏不仅收缩、舒张功能异常，心肌细胞的收缩(耗能)结构、产能结构均发生改变，且心肌微循环功能受损，因此肥厚心肌的能量代谢必然受到影响。在静息状态下，肥厚心肌ATP含量下降42%，PCr下降58%，总肌酸含量降低24%，PCr/ATP比值降低32%，ADP升高85%。肥厚心肌ATP和肌苷含量减少的原因及具体机制尚不清楚，可能与下列因素有关，包括腺苷酸前体的减少，心肌细胞膜损伤致摄取能力降低，线粒体/肌原纤维比值和毛细血管与线粒体之间的弥散距离的变化等，尤其可能与心肌细胞本身产能机制的改变有关，即肥厚心肌糖酵解活性升高，心肌细胞更多地选择葡萄糖而不是游离脂肪酸作为氧化供能底物。在底物可获得量减少的情况下，使ATP产量减少。

4.3 黄芪组分配伍对肥大心肌细胞ATP含量的影响

黄芪是1味传统的补气药，现代药理研究证明，黄芪含有皂苷、多糖、黄酮和微量元素等多种成分，具有多方面的药理作用[13]。特别是具有明显的心血管作用[14]，可以改善心脏的收缩及舒张功能[15]，临床常用于治疗心力衰竭。本实验发现，AngⅡ作用于心肌细胞24h，ATP含量无变化，48h引起ATP含量增加。黄芪皂苷或黄芪多糖或黄芪皂苷加多糖作用于AngⅡ致乳鼠肥大心肌细胞后48h，ATP含量高于正常组，但低于模型组，这是黄芪干预作用的结果，说明黄芪组分及组分配伍可在分子水平上抑制AngⅡ对心肌细胞能量代谢的影响，提示黄芪组分可能是通过对肥大心肌细胞能量代谢的干预作用预防心衰的发生发展，这就为黄芪防治心力衰竭提供了客观的实验依据。

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