荧光活性染料DiO在观察成骨诱导脂肪干细胞在脱钙骨材料上的生长与分布中的应用*

万光勇 张明宾

(泰山医学院附属泰山医院口腔科，山东 泰安 271000)

近年来，随着材料学、细胞生物学、分子生物学的迅速发展，利用组织工程学原理与方法再生组织、甚至器官的特点和优势得到广泛认同，而骨组织工程则是目前公认的最有可能在临床取得实际效益的研究领域之一。组织工程技术的发展迅速，为骨缺损治疗提供了新的前景。组织工程化骨的构建涉及三个重要因素，即种子细胞、生物支架、构建方法。在种子细胞细胞的研究方面，脂肪干细胞(ADSCs)目前是研究的热点[1-4]。骨组织工程中，体外将种子细胞和材料复合是组织工程体内构建的必经环节，体外培养过程中细胞的粘附生长状况将影响体内成骨的效果，观察体外培养过程是分析成骨过程中诸因素作用的不可缺少的方面，因此，需要有效的观测手段研究细胞在支架上的生长规律。本研究利用荧光活性染料DiO对人脂肪干细胞(hADSCs)进行染色标记，采用激光共聚焦显微镜观察了hADSCs在部分脱钙骨上(PDBM)的生长及粘附情况，取得了满意的观测效果。

1 材料与方法

1.1材料 部分脱钙骨：由上海组织工程中心提供(图1)。人脂肪干细胞：由脂肪抽吸组织中分离、培养[5]。3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate(DiO) Mol Probes公司(美国)。地塞米松、β-磷酸甘油、2-磷酸抗坏血酸购自Sigma公司。LSM-510激光共聚焦扫描显微镜：ZEISS公司(德国)。

1.2方法

1.2.1hADSCs的分离、培养 将脂肪抽吸物在无菌条件下装入175 cm2培养瓶中，带回实验室，时间不超过2小时h。用无菌的PBS反复冲洗至抽吸物溶液变清，以去除血细胞、碳酸氢钠、局麻药。加入等体积0.1%Ⅰ型胶原酶，在37℃恒温摇床消化1 h，1200 rpm离心10 min，获得高密度的细胞沉淀物，轻轻倾去上清液和漂浮的黄色组织，将细胞振荡混匀，加入DMEM+10%FBS培养液使细胞重悬。吸取少量细胞悬液用4%乙酸等体积稀释破坏红细胞，血细胞计数仪常规计数有核细胞数，按4×105有核细胞/cm2细胞密度接种于培养皿内，常用的100 mm塑料培养皿接种细胞 3×107左右，加入培养液8ml。将接种好细胞的培养皿置于37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度的条件下，培养24 h后首次换液。倒置相差显微镜下观察有大量细胞贴壁和漂浮的血细胞，用PBS反复冲洗去除漂浮的细胞，加入DMEM+10%FBS培养液。每周换液2次，细胞融合至80%传代。传代前用少量PBS洗涤一次，加入0.25% 胰蛋白酶和0.02% EDTA 2 ml,见大部分细胞胞质回缩、形态变圆，加入2 ml含血清的DMEM培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以2×104/cm2细胞密度接种于新的培养皿内进行传代培养，培养液用成骨诱导培养液(10%FBS基础培养液加入1 nmol/L地塞米松，2.16 g/Lβ-甘油磷酸钠，37.5 g/L 2-磷酸-抗坏血酸)。本研究选用第二代hADSCs。

1.2.2扫描电镜观察细胞材料复合物

1) hADSCs 与部分脱钙骨体外复合 将部分脱钙骨修剪成5 mm×5 mm×3 mm大小，钴60照射灭菌 ，将第二代hADSCs悬液按3×107/ml接种于部分脱钙骨材料上，采用将接种的细胞悬液反复滴加的方法，使接种细胞均匀地分布于材料上，将细胞材料复合物放置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育4 h，待接种细胞已粘附于材料上后，加入10%DMEM诱导培养液，隔天换液一次，并在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况。

2) 扫描电镜观察：第7天时，将细胞材料复合物取出，PBS轻轻冲洗，在2%的戊二醛中固定30 min；PBS漂洗3次；1%OsO4固定45 min；PBS漂洗3次；脱水：丙酮/醋酸异戊脂(1：1)10 min；醋酸异戊脂30 min ；临界点干燥；喷金；扫描电镜观察、照相，同时也行横断面扫描电镜观察、照相。

1.2.3hADSCs在部分脱钙骨上粘附率的测定 根据Kasten报道的方法[6]，做了部分改进。将部分脱钙骨修剪成5 mm×5 mm×3 mm大小，钴60照射灭菌 ，将第2代hADSCs按5×105/0.1 ml/块的浓度接种于部分脱钙骨支架上，共9块，采用将接种的细胞悬液反复滴加的方法，使接种细胞均匀地分布于材料上，将细胞支架复合物于37 ℃﹑5%二氧化碳培养箱中放置4 h后，换于另一平皿，加入培养液，将原平皿中加入0.25%胰酶0.02%EDTA，消化收集细胞，计数仪计数，得出流失的细胞量；细胞材料复合物培养24 h后，将细胞材料复合物于培养液中轻轻晃动，并换入另一培养皿培养，收集原培养皿培养液，加0.25%胰酶0.02%EDTA于原培养皿中消化收集贴壁的细胞，并与原培养液中细胞一并计数，得出未粘附的细胞数。细胞粘附率=(接种的细胞数-流失的细胞数-未粘附的细胞)/(接种的细胞数-流失的细胞数)。

1.2.4DiO标记成骨诱导的hADSCs细胞平面培养时单层细胞生长观察 将DiO用无水乙醇配成2 mg/ml的溶液，按1ul/1×107个ADSCs的浓度标记细胞；标记前，将所需体积的DiO溶液用无血清的DMEM稀释250倍，加入第2代ADSCs悬液中，在37 ℃﹑5% 二氧化碳培养箱中孵育20 min；离心1000转，5 min，弃上清；加入PBS冲洗，离心1000转，5 min，弃上清，重复1次；加入10%胎牛血清DMEM培养液，形成细胞悬液，台盼兰染色，计数。将标记的细胞以3×104/ cm2的浓度接种于培养皿中，观察细胞形态、生长。

1.2.5DiO标记hADSCs粘附率的测定 采用与测定未标记的hADSCs粘附率相同的方法检测DiO标记的第2代hADSCs在部分脱钙骨上的粘附率，共接种9块。将DiO标记hADSCs粘附率与未标记的hADSCs粘附率进行比较。

1.2.6激光共聚焦检测 细胞材料复合物于接种后第1﹑3﹑7天行激光共聚焦显微镜观察,并观察细胞在平面培养及支架材料上的生长情况。

2 结 果

2.1扫描电镜观察 体外培养7d后扫描电镜观察hADSCs与部分脱钙骨体外复合物，见部分脱钙骨表面的细胞粘连成片，将材料表面完全覆盖，孔隙中也充满细胞；细胞形态好，呈伸展状、多层立体生长(图2A)，基质分泌丰富。复合物横断面扫描电镜见材料内部孔隙中也充满细胞及基质(图2B)。

2.2hADSCs在部分脱钙骨上粘附率

表1 hADSCs在部分脱钙骨上粘附率

2.3DiO标记hADSCs观察细胞材料复合物中细胞的粘附生长

1) DiO标记的hADSCs粘附率为(94.5±2.2)%，未标记的hADSCs粘附率为(95.1±1.3)%，统计学分析两者无显著差异(P>0.05)。(图3)

2)DiO标记后，台盼蓝染色，见细胞活力好，仅偶见兰染细胞，荧光显微镜观察，见细胞标记后显黄绿色荧光(图4A)，标记的hADSCs细胞呈梭形，保持了良好的形态，细胞核未染荧光。

3) DiO标记细胞三维培养生长状况 激光共聚焦显微镜下观察，接种后第1d见细胞粘附于支架材料的实质性部分(图4B)或在孔的边缘上呈单层排列，细胞呈均匀的黄绿色荧光；接种后第3d见细胞数量逐渐增多，孔中细胞呈多层排列(图4C)；第7d细胞覆盖了大部分的材料表面，融合成片，荧光强度未见减弱，孔中充满了细胞(图4D)。

图1 部分脱钙骨呈白色、立体多孔状结构。

A：大体照片；B：局部放大；C：扫描电镜部分脱钙骨表面；D：扫描电镜横断面

图2 扫描电镜照片。

A：复合物表面；B：复合物断面

图3 DiO标记及未标记hADSCs的粘附率

图4 共聚焦显微镜观察hADSCs在部分脱钙骨上生长情况。 A：DIO标记第二代hADSCs，平面培养时发出黄绿色荧光； B：DIO标记第二代hADSCs，接种后共培养1d；C：共培养3d；D：共培养7d。(×100)

3 讨 论

骨组织工程中，体外将种子细胞和材料复合是组织工程体内构建的必经环节，细胞在材料上的粘附率是评价组织工程支架材料的重要指标。本实验检测了人脂肪干细胞在部分脱钙骨上的粘附率，实验结果也表明，人脂肪干细胞能较好地粘附在部分脱钙骨上，在部分脱钙骨的表面及内部孔隙中都能粘附，并能正常生长。符合骨组织工程支架材料的基本要求。人脂肪干细胞与部分脱钙骨的粘附率为96%，与Kasten[6]的研究结果相符合，DiO标记的hADSCs粘附率为(94.5±2.2)%，未标记的hADSCs粘附率为(95.1±1.3)%，统计学分析两者无显著差异(P>0.05)。这说明DIO标记hADSCs后，不影响其在部分脱钙骨上的粘附生长。

细胞-支架复合物的体外培养是构建组织工程化骨的一个重要步骤。体外培养过程中细胞的粘附生长状况将影响体内成骨的效果，观察体外培养过程是分析成骨过程中诸因素作用的不可缺少的方面，因此，需要有效的观测手段研究细胞在支架上的生长规律。相差显微镜是观察活细胞常用的方法，用来观测单层培养的细胞，骨组织工程细胞支架复合物厚度一般大于1 mm，多数支架材料透光性差，光镜下难以分清细胞形态。在本实验中，将成骨诱导后的脂肪干细胞接种在部分脱钙骨上，培养七天后通过扫描电镜观察，见部分脱钙骨表面的细胞粘连成片，将材料表面完全覆盖，孔隙中也充满细胞；细胞形态好，呈伸展状、多层立体生长，基质分泌丰富。复合物横断面扫描电镜见材料内部孔隙中也充满细胞及基质。实验结果表明，人脂肪干细胞能较好地粘附在部分脱钙骨上，在部分脱钙骨的表面及内部孔隙中都能粘附，并能正常生长。实验结果表明，部分脱钙骨对人脂肪干细胞有良好的细胞相容性。

DiO是亲脂性荧光染料，易嵌入生物质膜内并在膜内作侧向扩散运动,从而标记整个细胞。DiO无细胞毒性，对被标记细胞的存活、生长无影响，在标记细胞内消失慢。DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光，DiO被激发后可以发出绿色的荧光，本研究证实DiO能标记hADSCs，标记的细胞形态良好，DiO在hADSCs内表达稳定，体外培养7 d内未见荧光减弱。标记细胞接种于支架上后，第1天时，粘附于支架实质的表面，孔的边缘附着有单层排列的细胞，孔中无细胞。第3天时，见细胞数量逐渐增多，孔中细胞呈多层排列。第7天时，细胞覆盖了大部分的材料表面，融合成片，荧光强度未见减弱，孔中充满了细胞。在以往的实验察中，难以观察到支架实质表面的细胞分布，仅通过观察部分透光的孔中的细胞分布，往往不能对细胞材料复合物做出及时﹑正确的判断。标记的细胞在支架上呈均匀的梭形黄绿色荧光，很少见到未染荧光的细胞核区，这与支架表面凹凸不平的细微结构有关，细胞的各部分不是附着在同一平面上，激光共聚焦显微镜只能观察到细胞的一部分。在7 d体外培养中，DiO标记的ADSCs荧光表达稳定，不影响细胞粘附,能反映细胞在支架材料上的正常生长状况，因此，DiO标记是一种简洁﹑准确的观察ADSCs细胞在支架材料上状况的方法。DiO标记还用于观察鸡胚和新生小鼠晶状体纤维细胞[7]、小鼠的血管内皮细胞[8]、小鼠骨髓来源的内皮细胞[9]、人胎盘的血管内皮细胞[10]、猴虹膜色素上皮细胞[11]、猪的巨噬细胞[12]等，均报道其标记效果良好。

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