基因克隆常用的方法及其在甜菜上的应用

吴则东，王华忠

（1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨150080；3.中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080）

基因克隆常用的方法及其在甜菜上的应用

吴则东1，2，3，王华忠1，2，3

（1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；2.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨150080；3.中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080）

介绍了植物不同的基因克隆方法，并对基因克隆在甜菜上的应用及未来展望作概述。

甜菜；基因克隆；方法；应用

一般来说，基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。因此基因克隆技术又称为基因的无性繁殖、重组DNA、分子克隆、基因操作技术以及基因工程等。其目标是识别和分离特异基因并获得基因完整序列，确定其在染色体上的相对位置，阐明基因的生化功能，并利用生物技术手段应用到生产实践中去。目前，在油菜、玉米、水稻、烟草、拟南芥、番茄等多种植物中，已经克隆了许许多多与植物的产量、品质、抗性及农艺性状等相关的基因。

从遗传学观点来看，基因克隆有两条途径：正向遗传学途径和反向遗传学途径。正向遗传学是以研究突变表型来确定突变基因的传统遗传学方法；反向遗传学途径则通过有目的的对基因结构进行改造，以确认这些改变对于表型的影响。由于在多数情况下，我们并不清楚基因产物的结构和功能，很难通过正向遗传学途径克隆基因，而反向遗传学途径则显示了较好的前景[1]。反向遗传学中的3种主要的方法是转座子标签法、T-DNA标签法以及图位克隆法。近年来生物信息学的快速发展又促进了电子克隆的产生，生物信息学是以核酸、蛋白质等生物大分子数据为主要对象，以数学、信息学、计算机科学为主要手段，以计算机硬件、软件和计算机网络为主要工具，对已知的许多生物学原始数据进行搜集、整理以及分析，确定数据所含的生物学意义，研究重点在于蛋白质组学、基因组学、系统生物学及比较基因组学[2]。

1 基因克隆的途径

1.1 正向遗传学途径

1.1.1 功能克隆（functional cloning）功能克隆即已知基因的功能信息进行基因克隆的方法。也就是说我们虽然不知道当前的目的基因序列，但是对其编码的产物或者编码产物的生理生化性质非常清楚时采用的克隆方法。其具体做法是：首先从表型异常出发，找出导致出现异常表型的异常功能蛋白质，然后将蛋白质进行纯化，纯化后对此蛋白质进行氨基酸测序，根据氨基酸的序列信息合成寡核苷酸探针，在基因组文库或cDNA文库中去筛选目的基因或目的cDNA，最后克隆和定位这种异常蛋白质的编码基因。功能克隆是一种经典的基因克隆策略，很多基因的分离利用这种策略。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白来克隆基因。因此成功进行功能克隆的关键就是能够分离出一个纯度很高的蛋白质，只要有一个纯的蛋白质，得到特异的探针，这一方法是可行的。这就要求我们对其生理生化以及代谢途径研究得比较清楚。很多人都熟知的与镰刀型细胞贫血症相关的珠蛋白基因，就是利用功能克隆的方法。近年来利用功能克隆的方法有很多相关的基因被克隆。例如南京农业大学资环学院微生物学系克隆的硫代磷酸酯酶基因[3]、胡天华等人利用功能克隆的方法从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，CMV），并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因[4]、舒群芳等人利用此法在1995年构建了天麻cDNA文库，制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的cDNA克隆，为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础[5]。这种方法有其局限性，即只适用于克隆那些蛋白质产物及其相应功能都已清楚的基因，无法去克隆蛋白质产物还不清楚的基因。

1.1.2 表型克隆1995年Jonsson和Weissman提出表型克隆概念[6]，表型克隆是指某些植物除了在表型上存在差异外，我们对它的基因产物以及可用于基因定位的物理图谱知之甚少，因此可以利用表型差异或组织器官特异表达产生的差异来克隆植物基因。Sun等用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉素合成酶基因[7]。表型克隆在策略上就是利用表型的差异与基因结构以及基因的表达密切相关，从而可以分离特定表型相关的基因。可以不需要预先知道基因所对应的生化功能或对应的物理图谱，而仅仅根据基因的表达效应就直接分离该基因。但在实际操作过程中，验证所克隆的基因就是我们所希望得到的基因也需要耗费许多精力。

1.2 反向遗传学途径

1.2.1 转座子标签法转座子就是可以从染色体的一个位置自己转移到另一位置的DNA片段。发生转移的只是转座子的拷贝，在转移过程中原来位置的DNA片段并未消失。基因发生转座能够引起插入突变，使插入位置的基因失活并诱导产生突变型，或在插入位置上出现新的编码基因。通过转座子上的标记基因（如抗药性等）就可检测出突变基因的位置并克隆到该基因。该方法是把转座子作为基因定位的标记，通过转座子在染色体上的插入和嵌合来克隆基因的方法。对于无紧密连锁的分子标记的功能基因，采用这样的克隆办法是较为合适的。其缺点是筛选突变体的群体要求较大，因此需要的时间也较长。利用转座子标签法克隆植物基因首先要把已分离得到的转座子与选择标记构建成含转座子的质粒载体，然后把转座子导入目标植物，利用Southern杂交等技术检测转座子是否从载体质粒中转座到目标植物基因组中，这是转座子定位和分离目标基因所必须的步骤，最后对转座子插入突变进行鉴定及分离。通常用于克隆植物基因的转座子有玉米的Ac/Ds、Mu、Smp等。Ac含有编码转座酶的基因，能够自主转座，Ds不含转座酶所以不能自主转座，但Ds-Ac系统因Ac为Ds提供了转座酶就可以自主地转座了。用转座子标签法进行植物基因的分离，首要的是把Ac等转座子转化到要进行基因克隆的植物中。

1.2.2 T-DNA标签法T-DNA（Transfer DNA）是位于根癌农杆菌（agrobacterium tumefaciens）Ti（tumor inducing）质粒上的一段DNA，它可以从农杆菌中被转移并稳定整合到植物核基因组中。一般而言，改造的T-DNA载体被除去了致瘤基因，使农杆菌失去了原致病作用。T-DNA的主要优点是能够可载大到50kb的外源DNA；其整合不引起植物基因组大的重排；能完整和高频地进行转移；不需要植物染色体提供特异序列，可随机地整合且在表达活跃区域的整合几率较高；对特定的基因类别没有明显的插入偏向性，因此，在植物基因工程和基因克隆中被广泛引用。利用T-DNA作为标签，快速克隆功能基因的基本方法就是首先以人工构建好的T-DNA作为标签，通过农杆菌转化植物，构建突变体库，获得大量具有一定表型的突变体；再根据插入片段及人工扩增插入点侧翼的植物基因组序列与突变性状的共分离检测，最终实现快速鉴定和克隆功能基因。在水稻上，T-DNA标签法正在成为功能基因研究的重要方法[8]。

1.2.3 图位克隆法图位克隆（map-based cloning）又称为定位克隆（positional cloning），是由英国剑桥大学Coulson等人[9]首次提出的。近年来随着各种植物的分子标记图谱的相继建立而发展起来的一种新的基因克隆技术。其原理是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分子标记技术对目的基因进行精细定位的基础上，用目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步查（chromosome walking）逐步逼近目的基因或染色体登陆（chromosome landing）的方法最终找到包括该目的基因的克隆，并通过遗传转化试验证实目的基因的功能。随着各种植物的高密度图谱和物理图谱的相继构建成功，图位克隆技术在植物的基因克隆中有着更广阔的前景。图位克隆技术也有其局限性，就是利用图位克隆法克隆基因不仅需要构建完整的基因组文库，建立饱和的分子标记连锁图和完善的遗传转化体系，而且还要进行大量的测序工作，所以对基因组大、标记数目不多、重复序列较多的生物采用此法不仅投资大，而且效率低。因而图位克隆法仅局限应用在人类、拟南芥、水稻、番茄等图谱饱和生物上。此外，在分析发生的变异的时候，我们最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状由不止一个的基因位点控制[1]。

1.3 生物信息学途径

利用生物信息学途径进行基因克隆，就是近些年来发展起来的电子克隆（in silico cloning），也称为电子延伸（in silico elongation），是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆新方法，是基于EST的基因克隆技术。EST是长约200～600bp的基因表达序列片段，它是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后，大规模随机挑选DNA克隆，对其3'或5'端进行单次测序所获得的DNA序列，因此每条EST代表了全长DNA的一部分。由于同一条基因产生的多个克隆都有机会被测序到，尤其是测序量较大时，因此这几条EST经过拼接后就可能组成该基因的全长序列，电子克隆的技术原理是利用这些EST序列，借助电子计算机的巨大运算能力，通过EST或基因组的序列组装和拼接，利用RT-PCR的方法快速地获得新基因。首先，利用序列同源性比较软件（如Blast软件）将种子序列（例如甜菜抽薹的EST序列）对库检索；然后，从数据库中挑选出全部相关序列；第三，对所有序列进行片段整合分析，形成延伸后的序列，称新生序列。随后，将此新生序列作为种子序列重复进行上述三步过程，直至新生序列不能被进一步延伸为止，通过完整性分析即获得了全长的新基因序列。

与传统的基因克隆方法相比，电子克隆主要有以下优点：首先，电子克隆的速度快。因为大部分的操作都是在在计算机上完成，只需RT-PCR序列验证即可。其次，投入低。电子克隆只需能够上网的计算机和PCR仪等仪器即可进行，不需要购买太多的药品以及仪器，实验成本较低。第三，技术要求低。实验室工作只涉及到RNA抽提、反转录、PCR扩增等分子生物学的基本实验。第四，针对性强。拟克隆基因的生物学功能大都比较明确，一旦获得即可直接应用于转基因技术进行作物品种改良[10]。

国际上Boguski[11]等学者在1994年开始利用电子克隆方法发现新基因。电子克隆技术应用的前提条件要具备拟研物种的丰富核酸序列信息，其他物种相关基因的信息，以及强大的计算机硬件和相关生物信息学分析软件。基因组和EST资料的丰富程度决定了电子克隆得以在人类、小鼠等生物中广泛应用。由于受到序列资料的限制，植物基因的电子克隆还鲜有报道。但随着植物基因组计划和功能基因组学的发展，电子克隆在植物基因工程研究中必将发挥出巨大的功用。

2 基因克隆在甜菜上的应用

我国甜菜基因克隆起步较晚，和水稻等其它的粮食作物相比较还有很多工作要做，但近年来也有一些基因被克隆，取得了一些成绩。

2.1 在抗病虫方面

甜菜丛根病是由甜菜多粘菌（Polymyxa betae）传播的甜菜坏死黄脉病毒（beet necrotic yellow vein virus, BNYVV）所致的一种毁灭性土传病害[12]。抗病育种是对付该病唯一有效的途径,但也只能引起基因重组而不能创新。植物基因工程的应用在很大程度上弥补了常规育种引入基因的缺陷,并可创造出新基因。U.Ehlers等对甜菜的BNYVV病毒的外壳蛋白基因进行的克隆，并进行了表达验证[13]；姚华建等也克隆了BNYVV外壳蛋白基因，并通过农杆菌介导转入甜菜下胚轴,得到了转基因再生植株[14-15]；王琦等对于BNYVV的传毒介体甜菜多粘菌基因组片段进行了克隆并部分测序，并将其应用于甜菜多粘菌P.betae侵染甜菜苗的早期快速检测[16]。随着QTL研究的发展，很多重要的抗性基因也分别被定位在甜菜的染色体上，例如利用QTL分析，把抗丛根病和根腐病的基因定位在甜菜第三号染色体上，认为甜菜第三号染色体是主要的包含抗病基因的染色体，为进一步克隆抗性基因打下了良好的基础[17-18]。在抗虫方面，1997年Cai等利用定位克隆的方法克隆了甜菜的抗线虫基因[19]，这是在甜菜抗虫基因克隆上取得的重大突破。

2.2 在甜菜生理生化方面

甜菜生理生化方面的基因克隆这几年国内外做的比较多，例如陈胜勇利用RT-PCR方法进行甜菜胞液型谷氨酰胺合成酶mRNA、质体型谷氨酰胺合成酶mRNA(GS2mRNA)和质体型谷氨酰胺合成酶的基因组基因（GS2DNA）的分离克隆[20]；侯静等运用RT-PCR并5'/3'-RACE法首次分离了甜菜的硝酸还原酶（NR）基因，在此基础上，利用生物信息学手段对甜菜NR cDNA推导出的蛋白质序列进行主要结构分析和功能预测，旨在从酶分子的结构上揭示甜菜硝酸还原酶的调控机理[21]；2008年张杰等人对甜菜硝酸还原酶cDNA全长序列进行了克隆[22]；崔杰等人对甜菜ATP合酶β亚基基因atpB进行了克隆，并对序列进行了分析[23]；戴建军等分别以低温诱导的甜菜幼苗为试验组，以未诱导的甜菜幼苗为对照组，以代表性差异分析方法，克隆了低温诱导的甜菜幼苗差异表达基因片段，进行了cDNA的末端快速扩增，并进行了DNA测序[24]；2010年李建平等对甜菜蔗糖磷酸合酶基因进行了克隆，并对其表达进行了验证[25]。2002年，A.El-Mezawy等人构建了甜菜抽薹基因的高分辨率图谱[26]，为进一步克隆甜菜抽薹基因B打下了良好的基础。另外甜菜育性恢复基因及抽薹相关基因克隆的工作也正在展开。

3 甜菜基因克隆未来展望

生物的基因是一片海洋，在基因克隆的领域，人类已经迈出了坚实的步伐，目前已经有数百个物种进行了全基因组测序工作，例如水稻、拟南芥、油菜、高粱等等，而甜菜基因组测序工作到目前还未展开。深圳华大基因研究院2010年1月宣布启动“千种动植物基因组计划”，预计在未来两年内破译千种具有重要经济和科研价值的动植物物种基因组，已吸引了多所国内一流科研院校、研究机构以及加拿大、美国、澳大利亚、马来西亚等国际相关科研人员的加入[27]。我们有理由相信，随着国家投入力度的加大，甜菜基因组测序工作不会太遥远，到那时，伴随着测序工作的进行、计算机科学的发展，不同的基因克隆技术之间的相互交叉融合，会有越来越多的甜菜基因被克隆，探讨众多功能基因之间的调控网络也将成为今后的研究重点。从而把对功能基因调控作用的认识从单个基因水平上升到众多基因的网络层次，整合相关研究的信息以全面认识功能基因的调控网络，有助于从多维度系统水平上为利用功能基因进行甜菜基因工程改良提供理论依据。这一切都将大大加速甜菜育种的进程。

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Common Methods of Gene Cloning and Application in Beet

WU Ze-dong1,2,3,WANG Hua-zhong1,2,3
(1.The KeyLaboratoryofSugarbeetGenetics Breeding,HeilongjiangUniversity/Institute forCrop Research,HeilongjiangUniversity,Harbin 150080,China;2.The KeyLaboratoryofNorthSugarCrop Resource andUtilization,Chinese AcademyofAgriculturalSciences,Harbin 150080,China;3.SugarbeetResearchInstitute ofChinese AcademyofAgriculturalSciences,Harbin150080,China)

The different methods of gene cloning were introduced.The application of gene cloning and its prospect in beet were overviewed.

beet;gene cloning;methods;application

S566.3

A

1007-2624（2011）02-0059-04

2010-09-13

甜菜现代产业技术体系建设（nycytx-25-01-05）。

吴则东（1972-），男，黑龙江省依兰县人，助理研究员，中国农业科学院研究生院在读博士，主要从事甜菜遗传育种研究。