基因修饰的间充质干细胞在急性心肌梗死中的应用前景

瞿海龙,麻晓静,张 冰,梁 璐

间充质干细胞(MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞,能够向中胚层起源的各类细胞分化,目前已用于急性心肌梗死的临床研究。然而MSCs在体内存活时间短,其临床疗效有待于进一步提高。现就基因修饰后间充质干细胞在急性心肌梗死中的应用综述如下。

1 间充质干细胞的特性

MSCs在特定微环境和适宜的细胞因子作用下可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞和心肌细胞等[1]。此类细胞可从骨髓、脐带血及脂肪组织中提取。由于MSCs具有多向分化和体外自我增殖特性,使其成为再生医学的研究热点。体外研究表明MSCs具有免疫调节功能,能够抑制T淋巴细胞的增殖和抗原呈递细胞的成熟,同时可调节B细胞功能,抑制炎症介质的释放[2]。MSCs在体内可使宿主的巨噬细胞发生基因重组,调节炎症免疫反应,促进白介素-10的表达,减少败血症的发生[3]。

由于MSCs的再生特性和免疫调节作用,使其在治疗退行性疾病、炎症疾病、免疫系统疾病具有明显优势。然而从目前临床实验结果来看,尽管MSCs移植安全性高,但其疗效不容乐观,更多学者已将M SCs进行基因修饰后用于实验研究,以便取得更好的临床疗效。

2 间充质干细胞的提取与表型特征

MSCs可从各类组织中获取,其中以骨髓MSCs研究最为深入。目前,用于分离骨髓MSCs的方法主要有两种:贴壁筛选法和密度梯度分离法。贴壁筛选法根据MSCs可黏附在培养瓶上贴壁生长的特性,将抽取的骨髓细胞直接贴壁培养,经多次换液后去掉未贴壁细胞。该方法分离后所得的MSCs纯度不高。最常用的是密度梯度分离法。从动物骨髓中抽取骨髓,利用分离液对其离心,收集位于分离液和悬浮液界面的单个核细胞层培养,通过换液和传代纯化MSCs。

MSCs在无诱导物的培养液中生长成纺缍状成纤维细胞样,表达 SH2、SH3、CD29、CD44、CD27、CD90、CD105、CD106、CD166、CD120a、CD124,而缺乏造血干细胞表面的 CD34和白细胞表面的CD45标志[4]。

3 间充质干细胞的基因修饰

目前用于动物及临床实验的基因治疗多以病毒作为转染载体。尽管病毒载体对不同种细胞转染效率存在很大差异,但由于其趋向性和侵染性高,仍是应用最为普遍的载体。在人体基因治疗实验中应用最多的基因载体为腺病毒(adenoviruses Ad)、反转录病毒(retroviruses RV)、慢病毒。M cM ahon等[5]研究表明,不同组织来源的MSCs能够被Ad、Rv有效转染。Rv载体可整合到MSCs的DNA中,促进治疗基因的持续表达。然而有报道显示Rv转染造血干细胞后造成插入诱变,使其临床应用的安全性受到质疑[6]。Ad载体虽不能整合到宿主细胞的DNA内,但在注入动物及人体后可产生细胞和体液免疫反应,且由于Ad载体不能有效整合,只能促进增殖期干细胞转基因短暂表达。最近Stender等[7]利用腺相关病毒(adeno-associated viruses AAV)低免疫原性的特点,以其为载体,成功转染MSCs,使其成为另一种可供选择的病毒载体。

除病毒载体外,非病毒载体的研究与开发也成为基因治疗的热点。与病毒载体不同,非病毒载体具有设计灵活、低毒性、低免疫原性、低致瘤性、易制备、可批量生产等特点。目前用于MSCs转染的非病毒载体有脂质体DNA复合物、多聚物载体、电穿孔、核转染等。Hoare等[8]利用脂质体修饰的核定位系列多肽转染MSCs发现,非病毒载体是一种有效可行的方法,可加强MSCs治疗效应。然而非病毒载体的研究尚处于起始阶段,还存在着较多未解决的问题,例如,如何克服核膜障碍、如何降低血清成分干扰、长期应用是否存在安全性问题、如何提高通过受体获取靶向性的成功率等。因此,非病毒载体仍有待于随着基础科学的进一步研究而得到不断地发展。

4 基因修饰间充质干细胞在动物急性心肌梗死的实验研究

在过去的几年中,随着对基因修饰MSCs研究的不断深入,使其在治疗癌症、神经损伤修复、骨和软骨再生、急性心血管疾患方面取得显著实验成果。

Mangi等[9]认为促进MSCs抗凋亡信号蛋白 Akt的表达,能够提高梗死心肌的修复。在其随后的实验中,将反转录病毒转染的MSCs移植到梗死大鼠的心肌内,使其过渡表达促存活基因Akt,结果与对照组比较,可明显减少梗死心肌面积,抑制心室重构,提高左室射血功能。最初认为MSCs移植取得的治疗效益是由于其在体内分化为心肌细胞,而随后的研究显示其作用主要得益于促进抗炎症因子、促修复因子的表达[10]。

Li等[11]采用非病毒载体转染MSCs,促进另一种存活蛋白Bcl-2的表达,可以延长M SCs在梗死心肌内的存活时间,减少梗死心肌面积,提高左室功能。最近一项实验显示,应用腺病毒对MSCs进行血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)和干细胞归巢因子SDF-1双重修饰,在大鼠梗死后7 d移植到心肌内,这些移植细胞呈现心肌细胞和内皮细胞的表型特征,在移植后4周可明显提高梗死区血管密度,抑制心肌纤维化,提高左室功能[12]。

基因修饰MSCs在治疗急性心肌梗死具有以下特点:①与非转染MSCs相比,基因修饰MSCs可促进蛋白表达,提高其在梗死心肌内的停留与存活,促进抗炎因子和促血管形成因子的产生。②对MSCs进行2种或2种以上作用机制互补基因转染(如促存活基因和促血管形成基因)是安全可行的,而且将会成为提高干细胞疗效的首选方法;③从大量动物实验研究结果来看,目前用于基因转染的病毒载体和非病毒载体在人体内应用,应该是安全有效的;④对于基因修饰MSCs治疗动脉粥样硬化和急性心肌梗死的疗效,多源于大鼠的实验研究,其在大的实验动物中作用需进一步完善和证实;⑤目前基因修饰MSCs移植途径多采用直接心肌内注射的方法,静脉或冠脉途径移植却很少采用,而后两种方法在临床研究中更具有实用性,因此动物实验需完善相关研究。

5 基因修饰MSCs在临床中的应用前景

尽管基因转染MSCs在实验动物研究中取得显著疗效,但目前尚未进入临床阶段。载体系统在人体内的有效性和安全性是首要考虑的问题。最近发展的第三代腺病毒载体,由于结构中仅含有极少量残存腺病毒DNA,可减少其在体内引起的免疫反应,使其有望成为进入人体的一代载体。能够促使基因长期表达的位点特异性重组载体,目前也正在研制之中。基因修饰MSCs治疗急性心肌梗死要进入临床实验需满足以下几点:①需开发一种安全、高效的基因转染系统,能够促使基因持续且长久表达;②实现基因修饰 MSCs与生物支架的有效结合,为MSCs的体内存活提供稳定的内环境;③实现M SCs的大规模无血清培养,以保证临床经济有效的应用。总之,随着对基因修饰MSCs研究的深入,其有望成为不同于内科传统药物治疗、心血管介入治疗和外科手术治疗的又一全新治疗方法。

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