东乡县城污水中耐热大肠菌群的耐药性检测与分析

李仁道，何金德

(1、江西省东乡县疾病预防控制中心，江西 东乡 331800；2、江西省东乡县环境监测站，江西 东乡 331800)

抗生素在人和动物中的滥用所导致的微生物抗生素耐药性在国内外临床医学和畜牧兽医学研究领域一直受到高度重视，而其对生态环境所造成的负面效应还鲜为人知。随着抗生素的大量使用，部分没有被代谢掉的抗生素会随人和动物的排泄作用而不断进入环境，从而使得环境中的微生物长期处于低浓度抗生素的训化状态中，经过一定时间后也有可能逐渐产生耐药性。微生物耐药性产生的机理之一就是耐药基因的形成，比如抗性基粒。一旦产生这种基因，就有可能会引起更广泛的传播。欧盟各国学者最近的研究结果表明，环境中抗生素微量污染及抗生素耐药性细菌的存在和传播不容忽视[1，2]。

水环境中耐热大肠菌群的抗生素耐药性具有尤其重要的卫生学意义：水中耐药菌及其耐药因子能通过饮水或游泳等途径进入人体肠道进而将耐药性转移肠道寄居的细菌获得性耐药[3]。

进入污水处理厂的污水主要是居民的生活污水，也包含有医院排放的污水，抗生素残留的可能性很大。本研究从江西省东乡县污水处理厂二沉池中采集水样分离出耐热大肠群菌，并采用药敏试纸扩散法选用了15种目前临床上常用的抗生素，进行了抗药性的初步研究。

1 材料与方法

1.1 水样 东乡县污水处理厂始建于2009年，是一座现代化城市污水集中处理厂，污水主要来自县城区域的居民生活污水及两家县级医院排放的污水。平均日处理污水2.5～3万m3。本研究于2011年4月采取污水处理厂的二沉池的水样，用经灭菌的玻璃瓶装回实验室。

1.2 耐热大肠菌群的分离 耐热大肠菌群又称粪大肠菌群，是一类通常寄居于人和温血动物肠道,在44.5℃生长良好并发酵乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，主要包括大肠埃希杆菌(E.coli)、克雷伯菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷菌属(Serratia)和柠檬酸杆菌属(Citrobacter)。在受到粪便污染的水体中，此菌群与肠道致病菌具有相似的适应性和敏感性，存在时间大致相同，因此在水质监测中被用作粪便污染的优良指示菌[4]。

本实验参照美国《水和废水标准检验方法》[5]中的滤膜法在4h内对水样中的耐热大肠菌群进行检测分离。10ml水样加入90ml无菌生理盐水中充分混匀。用口径为47mm、孔径0.45μl的微孔滤膜过滤。滤膜细菌截留面向上，以滚动方式置于经改良的m-FC平板(以甲基蓝替换苯胺蓝)上，排除光滑面与平板表面的气泡。于37℃进行5h复苏培养后转至44.5℃培养19h。

对滤膜上典型蓝色菌落数为20～60的平板上菌落进行计数,计算耐热大肠菌群平均密度。用无菌接种针挑取各类形态的蓝色菌落50个，用LB培养基平板划线接种纯化，纯化菌株接种于半固体培养基37℃培养24小时后保存备用。

1.3 耐药性测定 采用纸片扩散法 (Kirby-Bauer法)[6]，按照临床实验室标准化协会(CLSI)的抗微生物药物敏感试验执行标准[7]判断结果。

1.4 质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922。

2 结果

2.1 耐热大肠菌群检测结果 污水耐热大肠菌群平均密度为为 9.2×102CFU/100ml。

2.2 药敏试验结果 50株耐热大肠菌群除对对亚胺培南全部敏感外，对其余14种抗生素均表现了不同程度的耐药，其中对氨苄西林耐药率最高为78%。具体耐药情况见表1。

3 讨论

表2 耐热大肠菌群对常用抗生素药物的耐药率

本研究实验结果表明，污水环境中耐热大肠菌群对常用抗生素存在一定程度的耐药性。与刘小云等通过水环境中耐热大肠菌群对10种常用抗生素的药物敏感性试验，表明水环境微生耐药性普遍存在的结论基本相符[8]。

在本实验中，分离出的耐热大肠菌群的耐药率由高到低分别为氨苄西林、四环素、环丙沙星、头孢他啶、左氧氟沙星、头孢曲松、头孢噻肟、头孢噻吩、哌拉西林、阿米卡星、头孢西丁、庆大霉素、阿莫西林/克拉维酸、氨曲南、亚胺培南，其中β-内酰胺类(包括青霉素类、头孢菌素类)的氨苄西林耐药率78%、头孢他啶耐药率为32%、头孢曲松耐药率28%、头孢噻肟耐药率26%、头孢噻吩耐药率为24%、头孢西丁耐药率20%、阿莫西林/克拉维酸17%。与常晓松等对医院污水污染水环境中耐热大肠菌群氨苄西林耐药率80.0%、头孢噻肟耐药率25.0﹪实验结果基本一致[9]。青霉素类、头孢菌素类是目前临床应用最为广泛的抗菌素，其在临床的大量应用导致针对此类抗菌素的耐药率升高，并占主导地位[9]。水环境中的耐热大肠菌群对青霉素类抗菌素产生这么高的耐药率，说明青霉素类抗菌素的滥用已经非常严重，不仅增加了临床耐药性传播的机率，而且导致了排放水环境中相应抗菌素耐药率的显著升高。水环境微生物耐药性形成的原因可能有：人和动物体内耐药菌及耐药因子向水环境的扩散，水环境中低浓度的抗生素对菌群产生的耐药性选择压力[2]。虽然其机机制并未确定，但水环境微生物耐药极有可能是公共卫生和生态环境的一大隐患。耐药微生物及耐药因子可经多途径侵入人体，将耐药性传递给体内致病菌，加大临床中感染性疾病的治疗难度[10-12]。

耐药性是微生物对抗菌药物的相对抗性，是细菌等微生物受到抗生素的选择性压力的反应，是微生物进化过程的自然规律，也是微生物耐药基因长期进化的必然结果。由于抗生药物杀死了敏感菌群，而对耐药菌的存活和繁殖无效，所以耐药性是过度使用和滥用抗菌药的必然后果。因此，人们应该严格控制抗生素的预防使用和非医疗中农、林、牧、副、渔以及饲料的抗生素使用，医疗机构应积极加强耐药监测，合理、规范选用抗菌药物，才能控制耐药菌株的出现与传播。

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