肾透明细胞癌miRNA-34a、Notch1和Hes1的表达及意义

杨 阳，崔苏萍，娄远蕾，谢 安，郭 菲，张明飞，汪 泱*

(1南昌大学研究生院医学部，南昌330006;2南昌大学第一附属医院;3南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所;4南昌大学第一附属医院烧伤研究所)

研究表明，许多miRNA与肿瘤的发生、发展、转归等有密切关系，在其中发挥癌基因或抑癌基因的作用［1，2］。Notch信号通路是进化上十分保守的信号通路，在细胞分化、增殖、凋亡、黏附、迁移及血管形成等方面都起到了十分重要作用，而异常的Notch信号途径与许多肿瘤的发生有关。已有研究表明，miRNA-34a的靶基因为Notch1。目前Notch信号通路与肾癌的关系不明确，与Notch信号通路相关的miRNA在肾癌中的研究也未见报道。本实验通过观察比较miRNA-34a、Notch1和Hes1在肾透明细胞癌组织与癌旁正常组织的表达差异，探讨其与肾癌发生发展的关系及可能的临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年9月～2011年1月在南昌大学第一附属医院泌尿外科行肾脏切除术患者的肾癌组织及其癌旁组织(规定距癌组织5cm以上)并保存于液氮中。取术后病理切片证明病理分型为肾透明细胞癌的病理组织共计48份。其中患者男31例、女17例，年龄21～75岁、平均52.5岁。手术方式:肾根治术41例(85.42%)，肾部分切除术7例(14.58%)。肿瘤按TNM(2002 AJCC)分期:Ⅰ期38例，Ⅱ期8例，Ⅲ期1例，Ⅳ期1例。按Fuhrman分级:1级24例，2级24例。肿瘤长径1.5～9.5cm，平均 4.43cm。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取 采用液氮研磨法将组织磨成粉末，加入Trizol按试剂说明书提取总RNA。

1.2.2 总RNA纯度和浓度的检测 使用超微量紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，记录OD260值。RNA纯度检测:RNA溶液的OD260/OD280的比值(比值范围1.8～2.1为纯度合格)。样品RNA浓度计算公式为:OD260×40×稀释倍数(ng/μl)。所提RNA －80℃保存备用。

1.2.3 逆转录 按Fermentas逆转录说明书操作。miRNA-34a用miRNA-34a茎环引物逆转录，其余用随机引物逆转录。miRNA-34a茎环引物见表1。

表1 RT、PCR引物序列

1.2.4 实时荧光定量PCR 按试剂盒说明书操作，分别以U6和GAPDH为miRNA和mRNA的内参。引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列及PCR产物片断大小见表1。数据采用2－△△CT法进行分析。变化倍数大于2为高表达，小于0.5为低表达，两者之间为无差别。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，数据用±s表示，比较采用配对样本t检验和两样本t检验，各指标间关系采用Spearman等级相关分析。P≤0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 肾癌组织及癌旁正常组织中 miRNA-34a、Notch1、Hes1的表达 48份标本中有33份肾癌标本miRNA-34a高表达，8例低表达，7例无差别;36份肾癌标本Notch1低表达，3例高表达，9例无差别;31份肾癌标本Hes1低表达，9例高表达，8例无差别。与癌旁正常肾组织相比，肾癌组织miRNA-34a、Notch1、Hes1 总的表达变化倍数分别为 4.093±3.661、0.497±0.724、0.498±0.872，均有统计学差异(P ＜0.05)。

2.2 miRNA-34a、Notch1、Hes1 的表达与肾癌临床病理参数间的关系 见表2。

2.3 肾癌组织中miRNA-34a与Notch1、Hes1的相关性 Spearman相关分析显示，肾癌组织中miRNA-34a与 Notch1、Hes1之间呈负相关(rs分别为－0.427、－0.549，P 均 ＜0.05)，Notch1 和 Hes1 之间呈正相关(rs=0.540，P ＜0.05)。

表2 miRNA-34a、Notch1、Hes1的表达与临床病理参数间的关系

3 讨论

miRNA-34a是抑癌基因p53的一个靶基因，作为抑癌基因的miRNA-34a除了协同p53促进细胞凋亡外，还通过调控 cyclinE、CDK4、E2F1和 E2F3蛋白表达水平参与调控细胞周期的G1阻滞［3］。已有研究表明，miRNA-34a在不同的肿瘤中有不同的表达情况。在恶性胶质瘤中，miRNA-34a是低表达的，通过靶基因C-met、Notch1和Notch2抑制大脑肿瘤生长，作为抑癌基因的miRNA-34a在神经母细胞瘤中也是低表达的。Dutta等［4］证实，miRNA-34a在氧化应激诱导的大鼠肾癌、宫颈癌的细胞系hela细胞和乳腺癌的mcf-7细胞中表达均明显升高，并证实miRNA-34a能促进肿瘤细胞的增殖。对miRNA-34a进行基因敲除后，肾癌细胞的增殖被抑制，从而表明miRNA-34a的过度表达在肾癌的发生过程中起到了重要作用。本研究48份标本中有33份肾癌标本miRNA-34a高表达。与已报道［5］的肾癌组织芯片结果相一致，提示miRNA-34a在肾透明细胞癌中作为癌基因起作用。

Notch信号通路由 Notch受体、Notch配体和DNA结合蛋白组成。当Notch受体和相邻细胞的配体结合后，Notch被蛋白酶两次切割，释放出具有核定位信号的胞内区，后者进入细胞核与DNA结合蛋白结合，调节靶基因表达，进而调控细胞的生长和分化等。越来越多的证据表明，异常的Notch信号与一些人类肿瘤的发生发展相关，但在不同肿瘤细胞中的具体表现又有明显不同。Notch信号途径在肿瘤细胞中具有双重特性，起癌基因或抑癌基因作用，如结肠癌、脑肿瘤、乳腺癌等人类实体瘤中均发现Notch1蛋白高表达起癌基因作用。而Hanlon等［6］则提出在胰腺导管腺癌模型中，Notch1作为抑癌作用促进肿瘤的发生发展。目前Notch信号与肾癌的关系尚不十分明确，Sjulund等在肾癌细胞株中测得Notch通路各组成蛋白存在并且高表达;Notch1和Hes1在肾透明细胞癌组织中的表达高于在正常肾组织中的表达。Sun等研究结果表明，与其相应的癌旁组织相比，Notch1在肾癌组织中低表达，且与临床分期有关。Hes1是碱式螺旋—环—螺旋转录因子家族的成员。作为Notch信号通路的下游基因之一，受Notch信号的正调控，其表达与Notch1表达相一致。本研究结果表明，Notch1、Hes1表达都是下调的，并且两者呈正相关。

Pang等研究证实 miRNA-34a的靶基因是Notch1和jag-1。通过转染证实，miRNA-34a对细胞的增殖无影响，但可通过下调靶基因Notch1和jag-1抑制细胞的侵袭。而Li等研究表明miRNA-34a通过靶基因C-met、Notch1和 Notch2可促进恶性胶质瘤的细胞增殖。本研究发现，miRNA-34a随着肾癌病理分级的增高而增高，Notch1的表达则随着肾癌病理分级的增高而降低;而且Hes1在肾癌组织中也是低表达;提示Notch信号通路可能经由高表达的miRNA-34a下调其靶基因Notch1参与肾透明细胞癌的发生发展。高表达的miRNA-34a有望成为肾癌诊断的分子标志物及潜在的治疗靶点。本研究还发现，miRNA-34a和Notch1的表达水平与年龄有关，因干扰因素太多，其具体的作用机制及可能的意义有待进一步研究。

［1］Liu J，Valencia-Sanchez MA，Hannon GJ，et al.MicroRNA dependent localization of targeted mRNAs to mammaliam P-bodies［J］.Nat Cell Biol，2005，7(7):719-723.

［2］Zhang B，Pan X，Cobb GP，et al.MicroRNAs as oncogenes and tumor suppressors［J］.Dev Biol，2007，302(1):1-12.

［3］He L，He XY，Lim LP，et al.A microRNA component of the p53 tumour suppressor network［J］.Nature，2007，447(7148):1130-1134.

［4］Dutta KK，zhong Y，Liu YT，et al.Association of microRNA-34a overexpression with proliferation is cell typer-dependent［J］.Cancer Sci，2007，98(12):1845-1852.

［5］Juan D，Alexe G，Antes T，et al.Identification of a MicroRNA panel for clear-cell kidney cancer［J］.Urology，2010，75(4):835-841.

［6］Hanlon L，Avila JL，Demarest RM，et al.Notchl functions as a tumor suppressor in a model of K-ras-induced pancreatic ductal adenocarcinoma［J］.Cancer Res，2010，70(11):4280-4286.