复黄生肌愈创油膏对糖尿病难愈性创面 TGF-β1、I、Ⅲ型胶原的影响*

肖秀丽 王振宜 唐汉钧 上海中医药大学附属曙光医院宝山分院中医外科(上海 201900)

创面愈合是皮肤外科领域中一个重要问题,而糖尿病、截瘫、局部射线照射等所致的创面临床愈合困难,因此探究创面修复与再生的机理,寻找有效地促进创面愈合的治疗方法,有着十分重要的意义。复黄生肌愈创(FuhuangShengji Yuchuang,FH-SJYC)油膏,简称复黄膏 ,是唐汉钧教授根据长期治疗皮肤创面的经验 ,根据其“瘀祛新生”理论所创制,对各种难愈性创面具有较好的效果[1]。为进一步探讨祛瘀生肌法促进创面愈合机制,本研究拟通过大鼠糖尿病创面模型外用复黄膏后创面中生长因子变化的动态研究,探讨其部分作用机理。

1 材料与方法 1.1 实验动物及分组 清洁级 Wistar大鼠,雄性,体质量(220±20)g,共 54只。由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,动物许可证号为医动字第 SCXK(沪)2003-0003号。用随机数字表法先按大鼠造模后换药 3d和 11 d两个观测时段将其随机分为 2组,每组 27只;再将每一时段的实验动物按随机数字表法分为创面对照组、模型组和复黄膏组,每组 9只。

1.2 药物组成及制备 复黄生肌愈创油膏(复黄膏),由紫草、血竭、大黄、龙骨、鸡蛋黄、珍珠层粉、猪皮、麻油等组成。由上海中医药大学龙华医院制剂室制备成油膏(药剂批号为040720)。正常对照组和糖尿病对照组:生理盐水(龙华医院提供)。

1.3 试剂和仪器 四氧嘧啶(Alloxan),试剂编号:2244-11-3,瑞士 FULKA公司产品(由上海中医药大学药理毒性实验室提供)。罗氏 ACCU-CHEK ACTIVE血糖仪和血糖测试试纸,编号:2005-10,22896931,瑞士 Roche公司产品。0.1%盐酸氯胺酮,试剂编号:KD061201,江苏恒瑞医药股份有限公司产品。RT试剂盒 DR019A,广州中山大学达安基因股份有限公司产品。M ARK D501A,上海宝生物工程技术公司产品。RN A反转录试剂盒,T AKARA公司产品。实时荧光定量 PCR试剂盒,美国 ABI公司产品。全自动实时荧光定量 PCR仪(美国 ABI 7300),美国 ABI公司产品。

1.4 实验方法 1.4.1 动物创面造模:糖尿病大鼠模型制造参照傅小兵等[2]方法改进,随机分为正常对照组 ,糖尿病对照组和糖尿病实验 (复黄膏)组,禁食 24 h后 (饮水不限),分别在乙醚麻醉下尾静脉 1次注射 1.5%四氧嘧啶(50 mg/kg,实验组)及等体积生理盐水(对照组 ),造模后 4 h后给予 5%葡萄糖水溶液饮用,次日经尾部取血测血糖,血糖值大于 10mmol/L上 ,则表明造模成功。模型制成后,每 3天测血糖 1次,直到动物处死。创面造模:糖尿病大鼠模型制造完成后 3d,参照傅小兵等[3]方法改进,Wister大鼠用 1%盐酸氯胺酮(3 mL/kg)腹腔注射麻醉。局部备皮,常规消毒后,于 Wister大鼠背部取直径为 3 cm左右圆形切口,剪开皮肤全层,至皮下筋膜,无菌敷料加盖 ,每日换药 1次。创面对照组造模方法同上。造糖尿病模型时大鼠共死亡 8只,在创面模型造模时死亡 5只,治疗、饲养过程中又有 3只大鼠死亡。最后可供实验观察的大鼠共 38只,其中 3和 11 d两个时间段各 19只 ,每个时间段又分为 3组,其中创面对照组 7只,模型组和复黄膏组均为 6只。

1.4.2 用药:3组大鼠于造模当日开始换药,换药前用 1:5 000呋喃西林清洁创面。创面对照组和模型组外敷单层生理盐水纱布,复黄膏组外敷单层复黄膏纱布。3组大鼠伤口均外用两层消毒干纱布覆盖固定 ,每日换药 1次。

1.4.3 动物创面面积测量及标本采集:用药后第 3天和第 11天,分别将动物麻醉处死。测量创伤面积,并计算创面闭合指数。计算公式:创面闭合指数=(1-治疗后创面面积/原始创面面积)×100%。用眼科手术剪分离新生创面肉芽组织,并成块取下,为所需实验样品。

1.4.4 Real-time RT-PCR实验步骤:1.4.4.1 引物、探针的设计与合成:根据 GenBank提供的 CRD-BP mRNA序列(LOCU S ID:AF198254),利用 Primer Premier5.0设计内、外引物及探针,引物均跨内含子序列,保证扩增的特异性。(引物、探针由中山大学达安基因诊断中心合成。)引物和探针序列Custom_NameSequence ProModify:FRT GF-β15'-CGCCT

GAGTGGCTGTCTT TTG-3'5'端 FAM修饰;3'端 Tamra修饰5'-GCTGCTGACCCCCACTGAT-3'5'-TGCCGGACAACT CCAGTGA-3'CollagenⅠ5'-AAGGCTGCAACCTGGATGCC ATCA-3'5'端 FAM修饰 ;3'端 Tamra修饰 5'-GGAGAGTA CTGGATCGACCCTAAC-35'-CTGACCTGTCTCCATGT T GCA-3'CollagenⅢ5'-ATGTCTGGAAGCCAGAACCATGT CA-3'5'端 FAM修饰 ;3'端 Tamra修饰 5'-CTACCTTGGT CAGTCCTATGAGTCTAGA-35'-TCCCGAGTCGCAGAC ACAT AT-3'GAPDH5'-CATCCTGGGCTACACTGAGGAC CA-3'5'端 FAM修饰 ;3'端 Tamra修饰 5'-CCGAGGGCCCA CTAAAGG-3'5'-GCTGT TGAAGTCACAGGAGACAA-3'

1.4.4.2 组织 RN A提取:将所试验的标本按序排放在管架,依次将各组组织转移至 5 mL玻璃试管中,依次每一管中加入 1 mL TRIzol(预冷 ),电动匀浆器 (转速 8000r/min)处理 30～ 45s。每标本间处理后用酒精(75%乙醇的配置∶ 1倍的DEPC处理水加 3倍的无水乙醇)棉球擦拭,DEPC处理水清洗。依次将匀浆液转至 1.5mL Eppendorf管中,各管中加入氯仿 200μL,激烈振荡 15s,4℃、12 000 r/min离心 15 min。小心吸出水层加入依次编号的 Eppendorf管中,再加入二倍体积的异丙醇(约 600μL),混匀,置于-20℃冰箱中,30min。 4℃、10 000r/min离心 15min,弃上清留沉淀。用 650μL75%乙醇洗涤沉淀,4℃,8 000 r/min,离心 5min,弃上清留沉淀 ,并重复此步骤 1次,充分吸尽残留液。打开管盖,干式恒温器 65℃,5～10min,烘干。 20μL DEPC处理水溶解 RNA,进行电泳并进行紫外分析测定,合格者-20℃冰箱保存待用。

1.4.4.3 RNA浓度测定:测同一样品在 260nm和 280nm光吸收值,若 OD260nm/OD280nm接近 2.0,则说明样品纯度高。

1.4.4.4 RN A变性凝胶电泳:用 DEPC处理的适量蒸馏水,加热融化琼脂糖。待冷却到 60℃,加 10mL 10× MOPS电泳液和 18mL 37%甲醛至终浓度为 2.2mol/L。混匀后,浇板,插梳。 取 RNA 20～30 μg溶于 4.5μL DEPC处理的蒸馏水,加2μL10× MOPS电泳液 3.5μL,甲醛 10μL甲酰胺 (终体积为20 μL)。变性温度为 65℃,15min。样品变性后立即置于冰浴。加上样染色液,上样。将变性琼脂糖凝胶装入含有 1× MOPS电泳缓冲液的电泳槽(经 3%过氧化氢处理)中。预电泳 5min,加样品。电泳,50V,3h。电泳后,EB染色,照像(用薄膜包胶 )。

1.4.4.5 RT-PCR实验步骤:将 RT-PCR试剂盒从-80℃冰箱取出,复融,将 5×逆转录 buffer,dNT Ps,MM LV,上游引物 F,下游引物 R,10 000r/min,数秒。将经过稀释后的 RN A样本进行 RT,反应体系为:5×逆转录 buffer4μL、上游引物 F 0.4 μL、下游引物 R 0.4μL、dN TPs 0.2 μL、逆转录酶 MM LV 1μL、DEPC处理水 10 μL、RNA模板 4μL,总体积 20μL。依次插入预先设置(37℃ 1h、95℃ 5min)加热模块。逆转录 cDN A完成,放入-80℃冰箱备用。

1.4.4.6 FQ-PCR检测实验步骤:取出实时荧光定量PCR试剂盒(达安公司 )解冻,取出消毒好的 96孔联体反应板,分别加入 cDNA模板。 依次加入 Taq酶 1μL、dN TPs0.5μL、上、下游引物各 0.5μL、荧光标记探针 0.5μL、5×buffer 10 μL、ddH2O 32μL、cDNA 5 μL,总体积 50 μL。放入全自动实时荧光定量 PCR仪(美国 ABI7300)板槽中。扩增条件:50℃ 2min,95℃ 10min,95℃ 15s、60℃ 1min,共 40个循环,反应完数据保存。

1.5 统计学方法 采用 SPSS11.0统计软件包对相关数据进行统计分析。在统计过程中进行了正态分布检验和方差齐性检验,数据满足方差分析条件,组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用 t检验,P＜0.05具有统计学意义。

2 结 果 2.1 复黄膏对糖尿病大鼠创面闭合指数的影响 在用药第 3天和第 11天,模型组的创面闭合指数均明显低于创面对照组(P＜0.05);复黄膏组的创面闭合指数则明显高于模型组(P＜0.05),与创面对照组相当(P＞0.05)。见表1。

表1 复黄膏用药第 3天和第 11天对大鼠糖尿病创面闭合指数的影响(±s,%)

表1 复黄膏用药第 3天和第 11天对大鼠糖尿病创面闭合指数的影响(±s,%)

△P＜0.05,vs创面对照组;▲P＜0.05,vs模型组

创面闭合指数组 别 n 3rd day 11th day创面对照组 7 3.11±1.53 77.62±10.00模型组 6 0.78±0.57△ 42.39±9.78△复黄膏组 6 2.36±1.30▲ 78.01±8.85▲

2.2 复黄生肌愈创油膏对糖尿病大鼠创面中 TGF-β1、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原 mRNA表达影响 创面修复 3d时,复黄膏组创面中 TGF-β1mRN A表达量均明显高于模型组(P＜0.05),但和创面对照组比较无统计学差异;Ⅰ、Ⅲ型胶原 mRN A表达量 3组间比较无统计学差异。见表 2。创面修复 11d时,复黄膏组创面中 TGF-β1和Ⅰ型胶原 mRNA表达明显低于创面对照组(P＜0.05),但和模型组比较无统计学差异;复黄膏组Ⅲ型胶原 mRNA表达明显高于模型组(P＜0.05),但和创面对照组比较无统计学差异。见表 3。

表2 复黄生肌愈创油膏对糖尿病大鼠创面3dT GF-β1、Ⅰ 型胶原、Ⅲ 型胶原m RNA水平影响 (±s,%)

表2 复黄生肌愈创油膏对糖尿病大鼠创面3dT GF-β1、Ⅰ 型胶原、Ⅲ 型胶原m RNA水平影响 (±s,%)

▲P＜0.05,vs模型组

Group n TGF-β 1 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原创面对照组 7 2.82± 3.08 2.37± 2.85 2.80± 3.55模型组 6 1.10± 1.23 1.98± 1.14 0.69± 0.62复黄膏组 6 4.76±3.63▲ 1.49± 1.32 2.49± 3.26

表3 复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面 11d T GF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原m RNA水平影响(±s,%)

表3 复黄生肌愈创油膏对大鼠糖尿病创面 11d T GF-β1、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原m RNA水平影响(±s,%)

△P＜0.05,vs创面对照组;▲P＜0.05,vs模型组

Group n TGF-β1 Ⅰ型胶原 Ⅲ型胶原创面对照组 7 2.69± 1.63 7.16± 5.93 2.33± 1.98模型组 6 0.33± 0.30* 0.87± 0.62* 0.45± 0.24复黄膏组 6 0.53± 0.32* 1.77± 0.99* 3.56± 2.31▲

3 讨 论 复黄生肌愈创油膏是根据糖尿病溃疡“虚甚瘀重,瘀甚虚重”的病机立法,以祛瘀扶正,方以大黄、蛋黄油为主药,一以活血祛瘀,一以扶正生肌;以紫草、血竭助大黄祛瘀止痛,珍珠粉等助蛋黄油生肌收口,佐以龙骨收疮敛口,麻油生肌润肤;象皮敛疮生肌 ,促进局部伤口愈合。全方合用,有活血祛瘀、生肌收口之功效,在临床促进难愈性创面愈合治疗上取得了一定的疗效[4]。本实验中动物模型创面闭合指数结果显示,复黄膏组的效果接近创面对照组。 TGF-β是成纤维细胞的强效趋化因子,可以通过旁分泌和自分泌直接或间接、单独或协同、同时或不同时相作用于炎症及修复细胞,产生细胞的趋化性迁移、增生分化,细胞外基质合成及分泌三类重要的生物学效应。陈伟等[5]研究发现:机体内 TGF-β的 3种异构体的生物学功能不尽相同,与 TGF-β2、β3相比 ,TGF-β1与伤口修复愈合的关系最为密切。创面修复延迟的原因可能是由于溃疡处的TGF-β1因子含量下降 ,而 TGF-β2和 TGF-β3蛋白表达增强 ,引起肉芽生长缓慢,血液供应不足,基质纤维蛋白代谢失调等,最终导致溃疡的发生[6]。用药 3d时,实验结果表明:复黄膏组 TGF-β1mRNA百分比数值明显高于模型组,P＜0.05,但和创面对照组比较无统计学差异 ,与 TGF-β1蛋白检测结果一致。提示复黄生肌愈创油膏在创面愈合早期可以促进糖尿病难愈性创面中 TGF-β1的分泌,从而达到促进创面愈合的作用。在已知的细胞因子中 TGF-β被公认为是最重要的致纤维化细胞因子,是促进成纤维细胞表型转换的重要因子。抑制 TGF-β1的生物学作用可降低成纤维细胞增殖,有助于改善增生性瘢痕的形成,对萎缩性瘢痕的治疗有一定的指导意义。用药 11d时,实验结果表明:复黄膏组创面中 TGF-β1mRNA含量明显低于创面对照组(P＜0.05),但和模型组比较无统计学差异;与 TGF-β1蛋白检测结果一致。提示复黄生肌愈创油膏在创面愈合后期可能具有抑制糖尿病难愈性创面中 TGF-β1分泌的作用,从而降低纤维细胞过度增殖,减少瘢痕形成。

胶原在创伤修复中是构成修复组织的主要细胞外基质成分,对于修复过程的完成有着极其重要的作用。愈合初期成纤维细胞被激活,合成和分泌胶原,胶原的产生既是创面修复的重要过程,也是瘢痕形成过程的决定性因素,故调控胶原的合成对于促进创面愈合,减少瘢痕形成有着重要的意义。胶原在创面修复过程中,作为修复质量的终结指标,决定着创面是否能顺利修复,以及修复质量高低[7]。而胶原的类型很多,其中含量最丰富的是Ⅰ型和Ⅲ型胶原,在创面愈合过程中,Ⅰ、Ⅲ型胶原起着重要作用。Ⅰ型胶原纤维直径为 100～ 500 nm,Ⅲ型胶原直径为 40～60 nm,愈合的伤口中Ⅲ型胶原出现得比Ⅰ型胶原早[8]。Ⅲ型胶原含量越高 ,胶原纤维越细,弹性越好,说明瘢痕的纤维化程度越低,胶原纤维就越细,形成的瘢痕就越轻,故提高Ⅲ型胶原比例是减少瘢痕的重要手段[9]。本研究结果显示,在创面修复的第 3天 ,3组间Ⅰ型胶原 mRNA的表达无明显差异,但Ⅲ型胶原 mRNA的含量复黄膏组明显高于模型组(P＜0.05);在创面修复的第 11天,复黄膏组创面中Ⅰ型胶原mRN A表达明显低于创面对照组(P＜0.05),但和模型组比较无统计学差异;复黄膏组Ⅲ型胶原 mRNA表达明显高于模型组(P＜0.05),但和创面对照组比较无统计学差异。提示应用复黄膏具有促进Ⅰ型、Ⅲ型胶原增生作用,尤其在创面愈合早期就可促进Ⅲ型胶原的表达,后期可以部分抑制Ⅰ型胶原的表达,这可能是其促进创面愈合、减少瘢痕形成的主要机制之一。因此,复黄膏有可能通过促进糖尿病溃疡创面Ⅰ、Ⅲ型胶原增殖及调节二者的平衡,从而发挥其促进创面愈合的作用。

综上,复黄生肌愈创油膏在糖尿病溃疡创面愈合过程中可能通过影响 TGF-β1mRN A的分泌,从而调节Ⅰ、Ⅲ型胶原不同时段的表达,起到促进创面愈合的作用,同时可一定程度上减少瘢痕形成。

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