高效液相色谱法测定鱼粉中组胺含量

梅光明 ，郭远明 ，陈雪昌 ，张小军 ，朱敬萍 ，李铁军 ，龙 举

（1.浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江海洋水产研究所，浙江舟山 316100；2.浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316100）

组胺为一种生物胺，可在许多动植物中发现，是生物体中的组氨酸在微生物脱羧酶的作用下脱羧而产生[1]，少量的组胺不仅是机体炎症反应和免疫损伤的重要介质之一，而且对应答和炎症反应有着重要的调节作用[2]。但过量的组胺通过通过与细胞膜上的两类受体H1和H2作用而发生组胺中毒[3]。鱼粉作为优质的动物蛋白饲料原料被广泛使用于动物生产中。实际上使用不新鲜、腐败霉变的鱼制作的鱼粉很容易引起组胺含量过高，从而引起一系列组胺中毒事故[4-6]。我国食品卫生标准对水产品中的组胺限量有规定要求，但是还没有制定鱼粉组胺的限量标准。目前报道组胺的测定主要有分光光度法[7]、荧光检测法[8]和液相色谱分析法[9-12]。由于鱼肉基质的复杂性，普通光谱法容易受杂质干扰，定量不准确，因而本文探讨了利用高效液相色谱法来测定鱼粉饲料中的组胺。

1 材料与方法

1.1 材料

所用饲料为市售常见鱼粉饲料。

1.2 主要试剂

碳酸氢钠、氢氧化钠、氨水（浓度25%～28%）为分析纯，高氯酸为优级纯，甲醇、乙腈、丙酮和丹磺酰氯均为色谱纯，盐酸组胺标准品（C5H9N3.2HCl，德国 Dr.公司），纯度＞99%。

0.4 mol/L 高氯酸溶液：取 24 mL 高氯酸（ρ=1.67 g/mL），用水稀释至 1 000 mL；2 moL/L 氢氧化钠：取4.0 g氢氧化钠溶于50 mL水中；10 mg/mL丹磺酰氯溶液：称取0.20 g丹磺酰氯，用20 mL丙酮溶解；盐酸组胺标准储备液；准确称取8.3 mg的标准品于5 mL容量瓶中,用纯水溶解并定容，配成标准储备液，折算成组胺浓度为1.00 mg/L，避光4℃冷藏保存，使用时用水稀释成适当浓度的标准工作液。

1.3 主要仪器与设备

Waters 600E高效液相色谱仪（配2489紫外检测器），美国Waters公司；AL204型电子天平，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司；漩涡振荡器，德国IKA公司；Centrifuge 5810台式高速离心机，德国艾本德公司；SHA-B水浴恒温振荡器，江苏常州华普达仪器制造厂。

1.4 实验方法

1.4.1 样品提取

称取1.0 g（精确至0.01 g）样品于50 mL离心管中，加入10 mL的0.4 M高氯酸溶液，涡旋振荡2 min，于6 000 r/min离心6 min，上层清液移入25 mL棕色容量瓶中。残渣再用10 mL高氯酸溶液提取1次，离心后上清液合并于容量瓶中，最后用0.4 M高氯酸溶液定容至25.00 mL。取出1.0 mL移入5 mL容量瓶中，依次加入100 μL的2 moL/L氢氧化钠溶液、300 μL饱和碳酸氢钠溶液和2 mL丹磺酰氯溶液，盖紧盖子，在水浴恒温振荡器中50℃下避光反应50 min。反应完毕后，加入100 μL浓氨水，静置30 min，用已经定容至5.0 mL，振荡混匀，取适量的溶液过0.45 μm的有机相针式滤膜，供液相色谱测定。

1.4.2 色谱条件

色谱柱：Waters Sunfire-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相及流速：水—乙腈（10+90，含 0.01 mol/L 乙酸铵）+0.01 mol/L 乙酸铵（75：25）；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；检测器：紫外检测，检测波长为254 nm。

1.4.3 标准曲线

准确移取组胺标准贮备液，用纯水稀释成浓度分别为 2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 和 80.0 μg/mL 的标准品工作液各1 mL，然后按照1.4.1的衍生化步骤反应处理后供高效液相色谱分析。根据组胺标准品的保留时间定性，以峰面积为纵坐标，以组胺浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.4.4 回收率和精密度

称取1.00 g饲料样品，分别向其中加入一定量的不同浓度的组胺标准溶液，旋涡混匀放置30 min，然后再进行提取、衍生化反应和净化后进行高效液相色谱分析。

2 结果与讨论

2.1 衍生剂的选择

组胺分子中缺少发色基团，本身无紫外吸收，因此为了提高检测的灵敏度及其响应，必须衍生化反应才能经紫外检测。衍生方法有柱前衍生[13-14]和柱后衍生[15-16]，常见的衍生剂有邻苯二甲醛（OPA）[13]、丹磺酰氯[17]、偶氮试剂[7]、苯甲酰氯[18]等。

邻苯二甲醛（OPA）存在衍生试剂易失效、衍生物不稳定等不足之处，有文献报道组胺的OPA-亚硫酸钠衍生物的稳定性仅为20 min[19]，采用偶氮试剂比色法测定饲料中的组胺，易受鱼粉中杂质的干扰，苯甲酰氯也是测定组胺常用的衍生试剂之一，但苯甲酰氯不溶于水，与提取液分层，导致后续衍生化效果不佳，因此本实验采用了丙酮溶解的丹磺酰氯作为衍生试剂，能够保证衍生化效率。组胺与丹磺酰氯的反应式如图1所示。

图1 组胺衍生化反应示意图Fig.1 Schematic diagram of histamine derivatization reaction

2.2 色谱图

在上述实验条件下，得到组胺标准品、空白及空白加标样品色谱图如图2～4所示。

由图2～4结果可见，用本实验中的方法对鱼粉样品中的组胺进行提取、衍生化反应后经高效液相色谱检测，色谱图峰型较好，信号响应高，且无干扰杂峰，说明整个方法的提取和衍生化反应效果好。

图2 20.0 μg/mL组胺标准品衍生化后色谱图Fig.2 Chromatogram of histamine standard after derivatization

图3 阴性鱼粉样品衍生化后色谱图Fig.3 Chromatogram of negative fish meal sample after derivatization

图4 阴性鱼粉样品300 mg/kg组胺加标衍生化色谱图Fig.4 Chromatogram of negative fish meal after derivatization spiked at 300 mg/kg histamine

2.3 线性范围及检测限

图5为阴性鱼粉样品50 mg/kg组胺加标衍生化反应后的色谱图，目标峰信噪比大于10，方法回收率大于70%，由此可知50 mg/kg作为方法的定量检出限可以满足鱼粉样品中组胺的检测需要。

配制组胺的工作曲线浓度系列为2.0～80.0 μg/mL，衍生化反应后用配有紫外检测器的液相色谱分析，绘制标准曲线如图6所示，计算相关系数。实验结果表明：组胺衍生物在2.0～80.0 μg/mL浓度范围内呈线性关系，相关系数 R2=0.999 3，回归方程为 Y=3.01×104x+2.56×104。

图5 阴性鱼粉样品50 mg/kg组胺加标衍生化色谱图Fig.5 Chromatogram of negative fish meal after derivatization spiked at 50 mg/kg histamine

图6 组胺衍生物标准工作曲线Fig.6 Standard curve of histamine after derivatization

2.4 方法回收率和精密度实验

为验证该方法检测鱼粉产品中组胺含量的适用性以及方法的准确度和精密度，选取了市售2种鱼粉产品为测试对象，进行加标回收率和精密度实验。结果表明，2种鱼粉中添加组胺浓度为50～1 000 mg/kg范围内的3个加标梯度下，回收率均大于70%，相对标准偏差小于7%，满足分析检测要求。

表1 鱼粉样品不同加标浓度下的回收率和精密度实验Tab.1 Results of recovery and precision of spiked samples

3 结论

本文研究了利用柱前衍生和高效液相色谱仪测定鱼粉产品中组胺的含量，建立了合适的样品提取、衍生化反应条件等前处理方法和最佳色谱分离条件。该方法简便快速，基体干扰小，线性范围宽，回收率和检出限令人满意，可以适用于鱼粉产品中组胺的检测。