植物血凝素的不同提取方法及活性测定

陈元坤，廖明初 ，欧红萍，李 超，吴学渊

（1.四川省新兽药工程技术研究中心，四川 成都 611130；2.重庆市长寿区凤城畜牧兽医站，重庆 长寿 401220；3.成都农业科技职业学院，四川 成都 611130）

植物血凝素（PHA）是一种非免疫来源，是对糖及其缀合物可逆专一识别的蛋白质分子，广泛分布于植物、动物和微生物中。豆科植物的血凝素在成熟种子中占蛋白质总含量的10%左右。PHA可刺激T淋巴细胞增殖分化产生大量效应T细胞和细胞毒T细胞；又可同时刺激B细胞转化为浆母细胞后增殖分化为浆细胞，具有免疫增强的作用。本研究对菜豆血凝素的提取和活性测定作了探索，以期为兽用植物血凝素的开发提供参考。

1 材料

1.1 鸡子豆 购自超市。

1.2 鸡血 为本实验室饲养的健康公鸡，经翅静脉采取的新鲜血液。

1.3 器材 中空纤维超滤膜，截留分子量100KD（上海摩速科学器材有限公司生产）；JJ-2型高速组织捣碎匀浆机（常州菲普实验仪器厂生产），XFB-200小型高速粉碎机（吉首市中诚制药机械厂生产）。

2 试验方法

2.1 PHA的提取 称取200 g鸡子豆，粉碎，加入1 000 mL蒸馏水于4℃冰箱中放置，吸胀24 h。再加入200 mL蒸馏水搅拌均匀，在组织捣碎匀浆机内12 000r/min匀浆2次，每次5min，置4℃冰箱抽提24h。然后用纱布过滤，弃掉滤渣，滤液经4 800r/min离心20min，收集上清液。将上清液分成3份，一份保存于4℃，直接用于活性测定；一份加入（NH4）2SO4至40%饱和度，充分搅拌，置4℃冰箱过夜，将过夜后的抽提液4800r/min离心20min，收集沉淀，在上清液内再加入（NH4）2SO4至40%饱和度，收集沉淀，合并两次沉淀，用适量蒸馏水溶解后作活性测定；一份用截留分子量为100KD的中空纤维超滤膜进行超滤，收集超滤液和浓缩液作活性测定。

2.2 PHA血凝活性测定

2.2.1 鸡红细胞悬液的制备 采集新鲜公鸡血，用3.8%枸橼酸钠抗凝，3000r/min离心15min，去上清，收集沉淀的红细胞，再用生理盐水洗涤3次，最后用生理盐水配成1%～2%红细胞悬液，4℃保存备用。

2.2.2 活性测定 PHA活性测定采用红细胞凝集法。试验共分4个组，1组为鸡子豆提取的上清液，2组为（NH4）2SO4沉淀液，3组为超滤液，4组为浓缩液。每组取11支5 mL试管，分别编号为1～11号，在每支试管中加入100 μL生理盐水，在第1孔内加入PHA 100μL，混匀后从第1管吸取100μL加入第2管，混匀后再吸取100 μL加入第3管，以此类推，倍比稀释到第10管，混匀后吸取100 μL弃掉，第11管加入100 μL生理盐水作为空白对照。然后在每管加入100 μL 1%～2%红细胞悬液，振摇后于25℃放置2h，观察凝集结果。

血凝活性判定标准：液体澄清透明，红细胞全部凝集于管底呈网络状，轻摇可见整片凝集块或大的凝集块，为高度凝集（100%）；红细胞有大部分凝集，只有少许沉积于孔中心，沉积点边缘模糊，为大部分凝集（75%）；液体稍浑浊，液体中有明显的凝集物，凝集块较小，为中度凝集（50%）；液体浑浊，仔细观察可看到液体中有很小的凝集块，为轻度凝集（25%）；液体与对照组相似，红细胞形成边缘清晰的小圆点沉积于管底，轻摇红细胞即扩散，液体变浑浊，为不凝集（-）。使红细胞中度（50%）以上凝集的PHA稀释度即为PHA的血凝效价。

3 结果与讨论

3.1 PHA血凝活性测定结果 蒸馏水直接浸提的PHA 上清、40%（NH4）2SO4沉淀的 PHA、100KD 分子量超滤膜超滤的超滤液及浓缩液的PHA均能使1%～2%的红细胞悬液凝集，凝集效价依次为 28、27、29、27，空白对照管未发生凝集。结果详见表1。

表1 各组PHA血凝活性测定结果

3.2 讨论

从鸡子豆中提取的PHA经不同方法处理后，对鸡红细胞均有凝集作用，其中以100KD中空纤维超滤膜超滤后的PHA超滤液的凝集活力最强，其次为蒸馏水直接浸提的上清液，而40%（NH4）2SO4沉淀的和100KD分子量超滤膜超滤的浓缩液的凝集效果稍差。蒸馏水直接浸提的PHA上清太黏稠，可能混有大量的杂蛋白，而40%（NH4）2SO4沉淀的PHA在沉淀过程中也将杂蛋白沉淀下来，这可能是血凝活性稍差的原因，且沉淀过程中需用（NH4）2SO4沉淀两次才能使沉淀离心出来，其用量较大，成本较高，经济适用性差。100KD中空纤维超滤膜超滤后的PHA液体较澄清，血凝活性最好，原因可能是超滤去除了大分子杂蛋白，提高了活性成分的纯度。据报道，豆科PHA分子量为128KDa左右，由2个或4个分子量约30KDa的亚基组成，但其活性成分的分子量大小尚不清楚。为了探索其活性成分分子量的大致范围，本研究用蒸馏水浸提的PHA经过100KD中空纤维超滤膜超滤，结果显示，超滤液和浓缩液对鸡红细胞均有凝集作用，且超滤液的凝集效果好于浓缩液，说明100KD分子量以上的和100KD分子量以下的成分均有红细胞凝集活性。因此，对PHA的超滤应选择分子量高于128KDa的滤膜进行初步纯化。综合几种提取处理PHA的方法，认为提取PHA可以采用蒸馏水冷浸提取，初步纯化可以选择超滤的方法。

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