甜叶菊新品系的主要农艺性状及糖苷含量比较

杨文婷，吴 卫，蔡乾蓉，徐应文，魏 超

（四川农业大学农学院，雅安 625014）

甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni），简称甜菊，为菊科甜叶菊属多年生草本植物，原产南美巴拉圭一带，于1976年在我国引种试种成功[1]。甜叶菊富含甜菊苷（stevioside，简称ST苷）、莱鲍迪苷A（rebaudioside A，简称RA苷）等糖苷类物质，RA糖苷的甜度为蔗糖350～450倍[2]，热量仅为蔗糖的1/300，且味质好，口感最接近于蔗糖，是一种新型的绿色保健型甜味剂；ST糖苷的甜度为蔗糖的250～300倍[2]，有后苦味，作为甜味剂品质不及RA苷，但ST糖苷有很好的抗癌活性[3]和降低Ⅱ型糖尿病血糖浓度和控制高血压的作用[4-6]，在开发为医药保健产品上潜力巨大。甜叶菊中糖苷类成分结构相似，功能和作用却不尽相同，对于作为糖用或药用型的甜叶菊品种，生产上不仅要求其具备相应的高RA苷或高ST苷含量，还要求其高RA/ST比值或高ST/RA比值以利于工业生产中的提取分离。近年来，四川开始大面积栽种甜叶菊，本课题组于2007-2008年间从四川蒲江、绵阳、遂宁等地收集甜叶菊材料，优选单株，经连续3年的栽培观测和分类筛选，逐步选育形成4个比较有代表性的甜叶菊品系SR-1，SR-2，SR-3，SR-5。本文旨在对新选育出的4个甜叶菊品系的一些基本农艺性状、茎叶产量及品质指标糖苷含量进行考察比较和相关分析，为不同用途的甜叶菊育种提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

甜叶菊原始材料于2007—2008年收集自四川蒲江、绵阳、遂宁等地，经四川农业大学吴卫教授鉴定为菊科甜叶菊属植物甜叶菊（Stevia rebaudiana Bertoni），新选育出的4个品系于2010年6月扦插生根后移栽于四川农业大学教学科研农场，每个品系种植3个小区，每个小区栽种20株，株行距40cm×20cm，3次重复。

1.2 方法

1.2.1 农艺性状调查 于2010年8月中旬甜叶菊开花前期，每份材料分别按小区取样，每小区随机取样5株长势中等，具有代表性的植株，考察株高、中部茎节长、一级分枝数、叶长、叶宽、叶干重、茎干重等。叶形的划分参考文献[1]。

1.2.2 RA和ST糖苷测定 （1）仪器与试剂：Agilent公司1100型高效液相色谱仪（含脱气机、四元梯度泵、自动进样器进样、柱温箱、DA D检测器）、上海一恒科技有限公司HWS 28型电热恒温水浴锅、Thermo BR4i型冷冻离心机、Sartorius CP225 D型电子天平、HS6150 D型超声清洗器、Millipore Mill-Q型超纯水系统等。RA苷标准品为日本和光纯药业株式会社制，其纯度≥97.4%；ST苷标准品为成都曼思特对照品制，其纯度≥95.5%；乙腈为色谱纯；乙醇、Ca（OH）2、FeSO4·7H2O 等为分析纯。

（2）糖苷提取方法：精密称取甜叶菊粉末1g于50mL离心管中，加入蒸馏水20mL，盖紧离心管盖，80℃下恒温水浴浸提2h，期间搅拌2次。8000r/min离心10min，倒出上清液备用，残渣再加20mL蒸馏水水浴浸提 2h，期间搅拌 2 次。 8000r/min 离心 10min，合并两次提取的上清液，按 5∶3 的比例[7]加入 Ca（OH）2和 FeSO4·7H2O，80℃下静置沉淀2h，再8000r/min离心10min，取上清液定容至50mL，待测。3次重复。

（3）标准溶液的配制：分别称取RA苷标准品0.0510g和ST苷标准品0.0500g于50mL容量瓶中，用V乙腈︰V水=75︰25定容至刻度，再超声5min，得RA苷和ST苷标准溶液。

（4）色谱条件：色谱柱：Phenomenex Luna NH2 柱，4.6mm×250mm；流动相：V乙腈︰V水=75︰25；流速：1.2mL/min；柱温：30℃；检测波长：205nm；进样量：10μL。

（5）方法学考察：①精密度试验：分别精密吸取RA和ST苷标准溶液10μL，重复进样5次，记录结果，考察仪器精密度；②稳定性试验：分别精密吸取RA和ST苷标准溶液及试验样品10μL，分别在6、12、24、48、72 h进样测定，在同一色谱条件下进样，记录结果，考察仪器精密度；③重现性试验：取同一份甜叶菊材料，按1.2.2（2）的提取方法分别同时配制6份样液精密进样10μL，在同一色谱条件下进样，记录结果，考察试验方法重现性。

（6）样品测定：样品提取液经0.45μm微孔滤膜过滤，取供试品溶液10μL，进样，测定峰面积，以峰面积和标准曲线计算甜叶菊中RA苷和ST苷含量。

1.2.3 数据处理 由色谱工作站计算样品中RA和ST糖苷含量。采用Excel软件进行基本数据的统计，采用DPS v7.05软件进行数据方差和相关分析。

2 结果与分析

2.1 不同品系主要农艺性状比较

方差分析结果表明，4个品系间除一级分枝数差异不显著外，株高、节长、叶长、叶宽、叶长宽比、茎叶干重等农艺性状间均存在显著差异。多重比较结果表明，SR-3和SR-5品系植株显著高于SR-1和SR-2品系，中部节间长度也显著长于SR-1和SR-2品系。从表1中还可以看出，SR-1品系平均叶长6.40cm，叶宽1.66cm，长宽比3.09，叶形为披针形；SR-2品系平均叶长7.67cm，叶宽1.38cm，长宽比5.49，SR-2为4个品系中叶片最长、最窄的品系，叶形为柳叶形；SR-3品系的叶片长宽比为4个品系中最小，平均长宽比2.97，叶形为短椭圆形；SR-5品系叶片最大，平均叶长7.27cm，叶宽2.27cm，平均叶长宽比为3.21，叶形为大披针形。4个品系中无论是干叶产量、茎干产量还是茎叶总产量最高的都是SR-5品系，其次是SR-3、SR-1，产量最低的是SR-2。

表1 不同品系甜叶菊主要农艺性状（Duncan法）

2.2 不同品系甜叶菊糖苷含量比较

2.2.1 方法学考察结果 （1）精密度试验：分别精密吸取RA和ST苷标准溶液10μL，重复进样5次，测得RA和ST苷相对标准偏差 （RSD）分别为1.05%、1.37%，表明仪器进样精密度良好。（2）稳定性试验：分别精密吸取RA和ST苷标准溶液及试验样品10μL，分别在6、12、24、48、72 h进样测定，标准品的相对标准偏差（RSD）分别为1.14%、1.36%；样品的相对标准偏差（RSD）为2.18%。结果表明标准品及样品在72 h内有良好的稳定性。（3）重现性试验：取同一份甜叶菊材料6份提取液，精密进样10μL，测得相对标准偏差（RSD）均为2.45%，表明该方法的重现性较好。

2.2.2 不同品系糖苷含量 4个甜叶菊品系在糖苷品质上存在明显差异，其RA苷、ST苷、总苷（RA＋ST）含量及RA/ST比值等差异显著，4个品系间各指标测定结果见表2。从表中可以看出，4个品系的RA苷含量从高到低依次为SR-2＞SR-3＞SR-1＞SR-5，RA苷含量最高的品系是SR-2，其RA苷含量达11.59%；其次为SR-3，含量为8.70%；RA苷含量最低的品系是SR-5，RA苷含量仅为2.16%。4个品系的ST苷含量从高到低依次为SR-5＞SR-1＞SR-2＞SR-3，SR-5 和SR-1的ST苷含量分别高达17.39%和15.26%，ST苷含量最低的是SR-3品系，含量为6.93%。总苷含量（RA＋ST）从高到低依次为 SR-1＞SR-2＞SR-5＞SR-3， SR-3 品系可能是因生成较高的RC苷的缘故，总苷含量为4个品系中最低。4个品系中RA苷占总苷（RA＋ST）比例最高的是SR-2品系，其次是SR-3，分别占55.96%，55.68%。4个品系中ST苷占总苷（RA＋ST）比例最高的是SR-5品系，高达88.94%。RA/ST值SR-3品系与SR-2品系接近，但SR-2的RA糖苷、ST糖苷含量均显著高于SR-3。

表2 不同品系甜叶菊糖苷含量（Duncan法）

4个品系的甜叶菊糖苷测定的HPLC色谱图有明显区别，见图 1～4。结合图 1～4和表2中RA苷、ST苷含量及RA/ST比值可以看出，SR-1为高ST型甜叶菊品系，SR-2为高RA型品系，SR-3为高RC型品系，SR-5为高ST低RA型甜菊品系。

图1 SR-1品系HPLC图

图2 SR-2品系 HPLC图

图3 SR-3品系HPLC图

图4 SR-5品系HPLC图

图5 RA苷标品HPLC图

图6 ST苷标品HPLC图

2.3 各性状间的相关性

由表3可以看出，产量指标与株高、节长、一级分枝数、叶宽等农艺性状呈正相关关系，其中干叶产量与株高、节长、叶宽相关显著；茎干重与节长、干叶重呈极显著正相关，相关系数分别高达0.98、0.96。甜叶菊的品质指标ST糖苷、总苷及RA/ST比值等指标与农艺性状、产量指标间相关程度低或不相关；RA糖苷含量与产量指标间呈显著负相关，同叶干重、茎干重、茎叶干重间相关系数分别为-0.94，-0.90，-0.93，说明高RA苷含量甜菊品系，其产量往往会偏低；ST苷含量则与各农艺性状间相关均不显著；总苷含量除与一级分枝数间呈显著负相关外，与其他农艺性状间相关均不显著；RA/ST比值尽管与叶干重、茎干重、茎叶干重间相关系数值较高，分别为-0.73，-0.69，-0.72，但均未达显著水平；此外，RA苷与ST苷间呈较高的负相关关系，相关系数为-0.84，RA苷与ST苷间表现出此消彼长的趋势，但也未达显著水平。由此说明，尽管提高甜菊的产量会一定程度影响甜叶菊的品质，但仍有可能选出既高产，品质又符合生产所需的优良甜叶菊新品种。

表3 各性状间相关系数

3 讨论

一般认为ST苷和RA苷性状连锁，难以同时提高二者含量；同时提高产量和品质也是较为困难的[1－8]。本试验结果发现RA苷与ST苷间存在此消彼长的趋势，但未达显著水平。同时，尽管RA苷含量与产量指标间呈显著负相关，ST苷却与各农艺性状间相关均不显著；总苷含量除与一级分枝数间呈显著负相关外，与其他农艺性状间相关也均不显著。据此认为，虽然提高甜菊的产量会一定程度影响甜叶菊的品质，但仍有可能选出既高产，品质又符合生产所需的优良甜叶菊新品种。舒世珍等[9]的研究表明，甜叶菊的叶长、叶宽与总苷量有显著正相关关系，本研究结果与其不尽一致。究其原因，可能是材料不同所致。单株干叶产量与株高、中部茎节长及叶片宽度等相关显著，但一些对植株干叶产量可能构成影响的因子，如茎粗、总分枝数、单株叶片数等，本文尚未考察到。另外该试验所测产量比其他文献报道[9－11]相比偏低，其主要原因为所用材料是今年6月扦插苗，生育期偏短所致。为此，明年我们将进行进一步试验验证。

由于甜叶菊中RA苷甜度更高、甜味更佳，目前甜叶菊栽培上的主推品种大多为高RA含量的糖用型甜叶菊品种，而近年来的文献表明ST苷具有降低Ⅱ型糖尿病血糖浓度和控制高血压的作用[3－4]，并且ST苷还具有很好的抗癌活性[5]，有望开发成为新一代天然抗癌制剂，这使得选育高ST含量的药用型甜叶菊品种具有一定的前景。过去的甜叶菊糖用品种曾主要是高ST型品种，但ST苷含量一般在60%～80%[9]，新选育的SR-5品系为高ST低RA型品系，具有高ST/RA值、更高ST苷含量（ST＞88%）等特点，对于工业生产上ST苷的提取极为有利，且SR-5品系在4个品系中茎叶产量最高，可能是一个较好的生产药用ST苷的甜叶菊品系。而对于糖用型甜叶菊品种，要求其含有较高的RA苷含量和高RA/ST值，SR-2品系和SR-3品系都具有高RA/ST值的特性，虽然综合产量因素考虑，SR-3品系的RA苷产量更高，但由于SR-3中还有较高的RC苷含量，RC苷甜度低，生产中不希望掺杂此类成分，高RC苷含量无疑将繁化工艺程序，增加生产成本；而SR-2品系的RA苷含量较SR-3品系更高，虽然茎叶产量偏低，但通过进一步地从SR-2品系中优选长势繁茂的单株及良好的栽培管理等措施，SR-2品系更可能成为高RA苷糖用型甜叶菊育种的良好材料。

4个甜叶菊品系无论是在植株外观形态、茎叶产量还是糖苷品质上均存在显著差异，说明4个品系具有较为稳定的外部形态特征和生理特征，使将这4个品系进一步选育成不同品种成为可能。

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