不同无性系斑茅开花特性和花粉贮藏条件的研究

杨 昆 ，应雄美，管永江，马 丽，吴才文

（1.云南省农业科学院甘蔗研究所/云南省甘蔗遗传改良重点实验室，开远661600；2.云南省红河学院生命科学与技术学院，蒙自661100）

亲本之间花期同步是进行有性杂交育种的前提和条件。甘蔗及其近缘属种之间花期不遇，诸多优异种质难以杂交利用，导致其育种基础狭窄、血缘单一，使甘蔗育种处于拥有大量种质资源的同时又被育种血缘贫乏所困扰的被动局面[1]。

斑茅（S.arundinaceum）是多年生草本，属于甘蔗近缘属野生种。以优异的抗性、强宿根性、耐粗生和广适应性使其在甘蔗近缘属植物资源中占有重要地位，多年来，一直被甘蔗育种家们作为品种改良和突破性品种培育的重要资源；但是，由于它的花期普遍较甘蔗亲本早3～6个月，使其优异特性的利用大打折扣。多年来，为寻求调节不同属种和杂交双亲花期一致的方法，甘蔗种质创新科技工作者进行不懈的努力。近几十年来发展起来的花粉低温贮藏技术，以少投入，高效率，有性杂交灵活方便，不受时间、地点、空间和自然条件的限制等优点，引起了国内外育种工作者的高度重视，并进行了大量的研究[2－8]。本文对不同地理来源斑茅的抽穗开花习性进行观察并对花粉贮藏技术进行探索，以期为更多珍贵斑茅资源的有效利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以21份不同地理来源的斑茅无性系为材料，观察其抽穗开花特性，选取其中的无性系2～4条花穗作为花粉供体，研究其花粉贮藏技术；所有斑茅无性系材料来源于云南省农科院开远甘蔗研究所国家甘蔗种质资源圃。

1.2 试验方法

1.2.1 花穗及花药田间性状观察 自7月中旬起，观察21份斑茅无性系，以最先抽穗的斑茅无性系花穗抽出5cm剑叶时的日期为初始日期，观察、记录各个无性系包括从抽穗初期到抽穗末期的时间、完全抽穗后的花穗长度。

1.2.2 花粉收集及统计 斑茅盛花期在7月下旬至10月上旬，于每日下午4时至5时，观察斑茅无性系开花情况，选择其中抽穗2/3但未盛开的斑茅花穗无性系材料，剪取单株穗茎（带叶片）带回室内进行自来水养茎，每个无性系材料取 2～4条花穗，于次日8—9时收集花粉。

（1）花粉量测定采用同心圆法[3]：将盛开的花穗悬于洁净光滑的蓝色硬纸上，轻轻抖动，收集花粉，去除花药壁等杂质后，将花粉均匀摊平于白色硬纸的固定区域（半径分别为1、2、3、4cm的同心圆）内评级，分别评为“少”、“中”、“多”、“很多”4 级（同心圆法）。

（2）花粉量测定采用血球计数器法[9]：取斑茅不同无性系的1～2个花穗，采集充分成熟、饱满、未开裂的花药90枚，平均放入清洗干净的3个IP管中，自然干燥。待花粉充分散出后，每瓶滴入1%六偏磷酸钠溶液1mL，加盖充分摇匀，使花粉呈悬浮状态。然后吸取2～3滴悬浮液滴于血球计数板（16×25规格），显微镜下观察400个小方格的花粉粒数。每个材料重复9次，取平均值，经换算得出各材料每个花药花粉数量（N）：

N=（400 小方格内花粉数×10000×1）/30

1.2.3 花粉可育率的测定 将收集到的斑茅无性系花粉，分别撒在载玻片上，滴上少量的碘液，置于显微镜（10×40）下观察。凡是花粉粒成球形且被染成蓝褐色的可视为有活性的花粉，而呈三角形的或皱缩且未被染色或染色很浅的为没有活性的花粉。连续观察3个视野，平均后计算斑茅花粉的可育率。

可育率（%）=视野中被染色的花粉粒数/视野中所有的花粉粒数×100%。

1.2.4 花粉干燥及含水量的测定 测定花粉含水量时，将收集到的斑茅无性系花粉转移至洁净干燥的培养皿内，摊平，分别进行常温下3种不同干燥处理：自然干燥、硅胶干燥、抽真空干燥，干燥时间分别定为0、0.5h、1h、2h、3h，然后用MA100型红外水分测定仪（德国Sartorius）测定各处理花粉的含水量。

1.2.5 干燥处理低温贮藏后花粉活性的检测 将上述部分干燥处理后的斑茅无性系花粉转入洁净干燥的1.5mL的离心管中，用石蜡进行封存后，放入冰箱中进行不同低温处理（2℃、-20℃、-70℃）的贮藏试验，10d后再用培养法测定各处理花粉的生活力。用培养法检测经不同干燥处理的斑茅花粉的生活力，即：在凹型载玻片上滴1滴培养液 （100mL蒸馏水＋15g蔗糖＋0.05g硼酸＋0.03g硝酸钙＋0.01g硝酸钾＋0.02g硫酸镁＋0.5琼脂）[5,10-11]，然后用毛笔蘸斑茅花粉，在有培养液的载玻片上均匀撒上斑茅花粉，将玻片放入垫有湿润滤纸的培养皿中，放入26±2℃的恒温恒湿的培养箱中培养1～2h后，置于显微镜下观察花粉管的萌发情况。每个处理连续观察5个视野，最后统计出各处理的花粉萌发率。

3 结果与分析

3.1 斑茅抽穗开花特性的差异

斑茅的开花特性受原生地及海拔高度的影响较大。从表1可以看出不同无性系斑茅的抽穗期、开花类型、花粉量、花粉活性都存在较大的种内及地域差异。对表1数据进行相关性分析表明抽穗期与原生地海拔高度呈显著正相关，相关系数为r=0.7047**。而其性状皆表现出一定的负相关，但相关性不明显，花穗长度与原生地海拔相关系数为r=﹣0.081，花粉活性与原生地海拔间相关系数为r=﹣0.378，花粉活性与花穗长度相关系数为r=﹣0.228。从开花类型看，可分为6类，一类为全抽出后开花，占28.57%；二类为抽出2/3即开花，占4.76%；三类为抽出1/2即开花，占9.5%；四类为抽出1/3即开花，占23.8%；五类为抽出1/5即开花，占28.57%；六类为抽出即开花，占4.76%。从数据上看，全抽出后开花和抽出1/5即开花占了大部分，今后杂交利用时对花粉的采集可依据开花类型进行调整，使采集的花粉萌发率达到最大。

表1 不同斑茅无性系的抽穗开花特性

3.2 花粉量与花粉活性的关系

研究花粉量与花粉萌发率之间的关系将有利于提高斑茅杂交利用的授粉效率。在检测花粉量时，21个斑茅无性系材料全部采用同心圆法，取其中8个无性系材料进行血球计数法，相比同心圆法测量，血球计数板能精确测量花粉粒个数，而同心圆法在实际操作中更简便、直接反映花粉量多少。分析表2发现，在同一省份（如云南）不同海拔下，不同斑茅无性系材料的花粉量与花粉萌发率之间存在显著相关（r=0.7077**），说明云南斑茅无性系花粉的活性随着花粉量的增加而增大；随着海拔的增加，斑茅花粉量有减少的趋势；其余地区的斑茅因材料数太少，暂不能进行规律性总结。

表2 不同斑茅无性系花粉量和花粉萌发率测定结果

3.3 不同干燥处理及低温贮藏对斑茅花粉生活力的影响

研究斑茅花粉在不同干燥处理及低温贮藏下的生活力差异将有利于筛选出适合斑茅花粉贮藏的有利条件，提高斑茅杂交利用的效率。以斑茅（云南82-69）花粉为试验材料，比较不同干燥处理、不同低温贮藏条件对斑茅花粉萌发率的影响。从表3可以看出：（1）贮藏前的斑茅花粉生活力随着干燥时间的延长而降低，在自然条件下干燥3h，斑茅花粉生活力降到1.42%；硅胶干燥3h，斑茅花粉生活力降到2.24%，相比之下，抽湿干燥效果较明显，但对花粉细胞的损伤也是最大的，干燥3h后，斑茅花粉没有生活力。（2）斑茅花粉含水量随干燥时间延长而降低，比较3种干燥方式，抽湿干燥比硅胶干燥和自然干燥能更快地降低斑茅花粉含水量，硅胶干燥好于自然干燥。（3）贮藏前含水量的多少是影响斑茅花粉在贮藏过程中活力好坏的一个重要因素，因抽湿干燥对细胞伤害较大，造成在低温贮藏过程中花粉没有生活力。在本试验中，比较自然干燥和硅胶干燥斑茅花粉后的贮藏效果，含水量在4.3%～6.6%之间，贮藏10d的花粉有一定的活性。（4）在相同贮藏天数下，比较3种低温（2℃、-20℃、-70℃）贮藏下花粉活力的下降比率，随着温度的降低，花粉活力也在逐渐地下降，相比之下，硅胶干燥2h后，在2℃下贮藏花粉活力下降比率最低，仅为28.0%，其余低温贮藏的花粉活力下降比率都在40%以上，说明斑茅花粉经硅胶干燥2h后在2℃的低温贮藏效果较其它方式处理的要好。

表3 不同干燥处理及低温贮藏对斑茅花粉生活力的影响

4 讨论

（1）来源低海拔斑茅无性系材料的抽穗期较高海拔的斑茅无性系的抽穗期短，这与李富生[5]对蔗茅无性系的研究结果一致；说明低海拔区的温度较高，条件适宜，从而缩短了斑茅的抽穗开花时间；来自较高海拔地区的斑茅，由于温度较低，为了使自己能够在最适合的时机繁衍后代，它必须在不利的条件下，尽量延长自己的抽穗开花期，从而保证物种的延续。

（2）本试验中较好的低温贮藏条件为硅胶干燥2h，含水量在4.3%～6.6%，在2℃的低温条件下贮藏，这与前人研究其他植物花粉低温贮藏时含水量降到10%以下的结果一致[12]；花粉含水量越高，进行冷冻时越容易形成冰晶，使细胞膜受损，花粉死亡率就越高，不能达到贮藏的目的[2]。

（3）本文对不同无性系斑茅的开花习性及花粉贮藏条件进行了观察和初步探索，如果让斑茅花粉在相对长的贮藏时间下，达到最大的活性，今后还需做更加深入的研究。

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