分子标记在甜菜离子注入诱变育种中的初步应用

高文伟 ，马 林，沙 红，曲延英，于月华，刘 珊 ，李玉娇，王燕飞

（1.新疆农业大学农学院/新疆农业大学生物技术重点实验室，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院经济作物研究所，乌鲁木齐 830091）

分子标记辅助育种是利用与目标性状紧密连锁的DNA来对目标性状进行间接性选择，早代就能够对目标基因的转移进行准确、稳定的选择，而且克服隐性基因再度利用识别的困难，从而加速育种进程，提高育种效率，选育抗病、优质、高产的品种[1-13]。我国的农作物分子标记辅助育种的研究始于90年代初，在过去的近十年时间里，取得了重要的研究进展：（1）构建了水稻等作物的染色体遗传图谱；（2）构建了水稻染色体物理图谱；（3）利用分子标记对我国作物种质资源遗传多样性进行了初步研究；（4）对一些重要的农艺性状进行了定位、作图与标记，相应的基因克隆已在进行[8]。就甜菜而言，在国外RFLP、RAPD、SSR和AFLP分子标记已先后用于遗传图谱构建、遗传多样性检测、品种（系）鉴别及重要农艺性状的分子标记等方面的研究。然而开展甜菜高糖性、早熟性分子标记在国内还未发现有相关报道，尤其是本次利用离子注入诱变产生的高糖、早熟突变体做亲本进行分子标记研究尚属首次。

本实验以离子注入诱变获得的高糖突变体、早熟突变体和未经诱变处理的对照为材料，构建RAPD分子标记相关指纹图谱，为定位高糖、早熟性状相关的基因或QTL和利用甜菜的高糖性、早熟性指导育种实践，加快育种进程奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

甜菜优良亲本材料7208、离子注入诱变高糖体S10、早熟体W11。

1.2 方法

1.2.1 改良的SDS法 取甜菜叶片0.2g，同时把SDS提取液在65℃下预热，然后进行甜菜叶片的研磨。在研样中加500μL SDS提取液，之后装入离心管中并在65℃水浴锅下加热30min，在加热过程中，轻摇2～3次。取出，冷却后加氯仿异戊醇500μL轻摇至匀，离心（12000r/min，15min）。取上清液，加氯仿异戊醇离心（8000r/min，10 min）。再取上清液，用无水乙醇沉淀静置、离心（8000r/min，6min）。最后用70%乙醇洗2次，晾干，超纯无菌水溶解放置（4℃）冰箱中备用。

1.2.2 PCR反应 ⑴RAPD反应体系中的试剂及用量：Buffer 2.5μL，10M dNTPs 0.5μL，超纯无菌水 14.1μL，Taq 酶 0.4μL，Mg2＋2.5μL， 模板 DNA 4μL， 引物 1μL。 ⑵PCR 扩增条件：95℃预变性 5min，94℃变性 1min，37℃复性 1min，72℃延伸 2min循环 44次，72℃再延伸 5min，4℃保存。

1.2.3 电泳及染色 采用琼脂糖凝胶电泳，电压100V，时间25 min。最后在Bio-Rad自动凝胶成像仪上观察PCR结果。

1.2.4 带型分析 以0、1为标记，建立EXCEL分子标记数据库，0代表无条带，1代表有条带。

2 结果与分析

大量田间试验表明：通过离子注入后所获得的早熟性状和含糖率高的性状是稳定遗传的。因此本研究对其进行分子检测，以期获得与这些性状紧密连锁的标记，并利用分子标记来进行辅助选择育种或研究种质资源。

2.1 DNA的琼脂糖电泳检测

在已有工作基础上总结出一种简单，成本低廉，提取DNA效果又好的SDS方法。采用此方法提取效率较高，主带明亮，整齐一致，降解现象不明显。

2.2 RAPD体系的建立

甜菜优良亲本7208、离子注入高糖突变体S10和早熟突变体W11为材料，以离子注入诱变早熟体的RAPD分子标记筛选为技术基础[8]，根据其他作物的标记体系进行整合后，建立了适于甜菜的RAPD分子标记体系。

图1 DNA检测

图2 RAPD检测

此图证实了用改良的SDS法提取DNA可以应用到RAPD-PCR的扩增体系。在C1、T20、AE20、U15、C2、C11引物下离子注入诱变体与非离子注入诱变体的DNA条带有差异，同时两个离子注入诱变体S10、W11之间也存在差异。

2.2.1 多态性引物的确定 以 7208、S10、W11为材料，采用实验室建立起来的RAPD分子标记技术体系，从800条RAPD引物中筛选出扩增带型有差异且带型清晰稳定的引物。

表1 鉴定材料间差异的DNA多态性引物

从表1中看出有18个引物可以鉴别S10、7208之间的差异，也有18个引物可以鉴别W11、7208之间的差异。它们之间的引物并不是完全不同，V3、W5、C2、U15、AE20是它们共有的，占总引物的0.625%。有5个引物可以鉴别S10、W11之间的差异，占总引物的0.625%。由此可以证明虽然离子注入产生了高糖和早熟两个变异体，但是它们之间的差异比较小，这主要是因为它们大部分遗传物质和亲本7208相似。

2.2.2 带型统计分析 以0、1为标记，建立EXCEL分子标记数据库，0代表无条带，1代表有条带。

通过 7208、S10、W11的 RAPD 引物的筛选和特异性引物对应的DNA指纹（见表2、3、4）统计，可以建立相应的RAPD分子标记指纹图谱库，同时也可以看出：用一个引物很难确定是哪种变异，因此确定某一种变异应用多个引物的组合或指纹组合。

表2 引物所对应的S10、7208的DNA指纹

表3 引物所对应的W11、7208的DNA指纹

表4 引物所对应的S10、W11的DNA指纹

3 讨论

甜菜是两年生作物，通过常规杂交转育产生新的基因源，一则周期太长，二则在没有基因来源的情况下，很难获得新的创新材料。在甜菜理化诱变中，曾先后应用航天、钴60等诱变方法，但效果均不明显。离子注入技术具有定向性、多样性及安全性，有较高的突变谱。新疆在甜菜上利用离子注入技术获得了创新早熟亲本材料一份W11，含糖率增加的高糖亲本一份S10，而且此种变异可以稳定遗传[8]。

随机引物多态性DNA片断可作为分子标记。这种方法即为RAPD。尽管RAPD技术诞生的时间很短，但由于其独特的检测DNA多态性的方式具有快速、简便的特点，使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上，它是利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增[13]。聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离，经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片断的多态性，这些扩增产物DNA片断的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对于任一特异的引物，它同基因组DNA序列有其特异的结合位点。这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围内，就可以扩增出DNA片断。因此如果基因组在这些区域发生DNA片断插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数量很大，虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片断克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。

由本实验可知：利用RAPD检测可以区分7208、W11、S10三者的差异并且通过分析也验证了突变的低频性。利用RAPD检测可以区分7208、W11、S10三者的差异，正好和大田上三者之间存在有差异的结果是一致的，表明三者之间可能存在遗传物质上的差异。同时RAPD检测可以较早地对甜菜的种子进行室内检测，从而更早地对诱变体进行选择。但是用RAPD进行分子标记，存在重复性差等局限性，因此为了弥补RAPD和大田检测的局限性，还需要转换一种SCAR的特异性的分子标记技术来，更加准确地鉴定出离子注入诱变产生的变异。

4 结论

本文通过RAPD分析得到了7208、W11、S10之间有差异的引物；通过带型分析建立了7208、W11和S10的指纹图谱库。由实验可知：利用RAPD分子标记技术检测了甜菜突变体，检测差异的大小和大田检测进行比对，发现检测结果是基本一致的，从而也证明了RAPD分子标记技术是可以用于检测生物的突变体的，因此用RAPD分子标记对7208、W11、S10之间的差异进行监测，在早代进行选择，可以指导大田育种。再通过大田育种的结果来验证分子育种的可行性，以确认标记的准确性。

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