烟草遗传标记研究进展

徐双红,吴成林,戴林建,*,钟 军,孙焕良,潘 著

(1湖南中烟工业有限责任公司,长沙 410007;2湖南农业大学农学院,长沙 410128)

在植物分类学上,烟草(Nicotiana tabacum)属茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)。烟草属植物大多数是草本,少数是灌木或呈乔木状,一年生或多年生。目前已发现 66个烟属植物种,其中红花烟草和黄花烟草等一些有经济价值的种为人们广为栽培[1]。我国种植的烟草大部分是国外引进品种,育种速度落后于其它作物[2]。笔者认为,烟草的育种一方面应结合植株的表型选择及一些生理生化指标的测定,另一方面应从分子的层面研究品种选择问题,使烟草育种得到进一步发展。

遗传标记主要包括形态学标记(morphological marker)、细胞学标记 (cytological marker)、生物化学标记 (biochemical marker)和分子标记 (molecular marker)4种类型[3]。这些遗传标记在烟草上已开展了大量的研究,尤以分子标记的发展最为迅速,已成为烟草分子生物学的重要方面[4]。笔者就烟草遗传标记的研究发展概况及前景进行分析,以期为我国烟草育种提供参考。

1 形态学标记研究

形态学标记是指肉眼直接可见或可通过仪器测量的外部特征,如形态性状、生理性状及生态地理分布等特征为遗传标记,研究物种间的关系、分类和鉴定。烟草外部形态性状主要有叶形、叶片数、叶脉、叶面积、生长势、茎围、株高等。

陈学平等[5]对11个烟草品种成苗期的株高、叶片数、生物产量进行测定分析,发现品种间存在较大差异,晒烟、香料烟和黄花烟的平均株高、叶片数要远高于烤烟。因此,在苗期可根据株高、叶片数、生物产量作为不同类型烟草间的鉴定依据。相同类型品种的烟草由于在苗期性状差异不大,形态性状不能直接作为鉴定指标,还需进行进一步的种植鉴定。

何川生等[6]用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)对37个烟草品种的花粉表面结构进行观察,发现同一品种烟草花粉表面形态结构无明显差异,但烤烟、晒烟不同品种之间的花粉表面形态结构存在一定差异。烤烟、晒烟与野生烟之间形态结构差异十分明显,这种差异主要表现在萌发孔特征和花粉大小上。不同烤烟品种的萌发孔大小和形状表现出了明显的遗传特性,并认为此可以作为烟草分类、进化研究的重要依据。

2 细胞学标记研究

细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征,如染色体的结构特征及数量特征。染色体结构特征包括染色体的核型、染色体长度、着丝点位置、臂比、随体大小等。不同物种的染色体具有各自特定的形态结构,且这种形态特征是相对稳定的。

程晓蕾等[7]研究表明,在对烟草染色体制片中,用风油精溶液(20%)进行预处理效果最好,染色体分散度较高,收缩长度适宜,且可显示一定的带纹。应用烟草染色体显带技术,从核型分类和染色体带纹的差异来分析烟草不同亚属间染色体结构上的差异,确定其亲缘关系远近,可为烟草遗传育种的亲本选配等方面提供一定的参考。

3 生物化学标记研究

生化遗传标记是以生物体内的某些生化性状为遗传标记,包括同工酶标记、蛋白质标记、高效液相色谱等方法。一般以同工酶标记和蛋白质标记应用较广泛。

3.1 同工酶标记

同工酶技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色,把酶蛋白分子分离开来,并将其相应位置和活性情况直接在染色区带标记出来,该技术已逐渐成为分子水平研究的一种重要手段[8]。同工酶标记的优点在于环境因素对同工酶标记基本没有干扰,技术非常稳定,但同工酶标记的局限性在于可选择的同工酶种类少且其表达存在阶段特异性和器官特异性[9]。

侯留记等[10]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)对10个烤烟品种种子的酯酶同工酶(EST)进行了比较,结果表明,各品种的 EST酶谱可以相互区别,种子EST的PAGE酶谱可鉴别烤烟品种。王蕴波等[11]采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对 6种烟草幼苗中过氧化物酶同工酶数目进行对比,发现不同类型烟草间差异很大。陈学平等[12]针对国外引进烤烟品种和国内选育烤烟品种及一些地方烤烟品种共 64个品种进行酯酶同工酶的分析,结果表明这些烤烟品种种子中的酯酶同工酶具有遗传稳定的特性,这也说明同工酶标记技术对鉴定烤烟品种有重要意义。许明辉等[13]研究了烤烟与晒烟品种间同工酶的多态性表现,主要包括对种子、不同生育期叶片及花蕾的 9种同工酶进行分析,结果表明花蕾中的过氧化物酶可成为区分烤烟与晒烟的同工酶标记。

同工酶是具有相同催化功能而结构及理化性质不同的酶,其结构的差异来源于基因型的差异,因而个体同工酶差异直接反映着遗传基础的差异,所以利用同工酶标记技术对烟草不同群近缘种内或品种间比较,进行遗传多样性分析,探讨种间分类问题及品种间的相互关系,为形态分类提供佐证,具有重要意义[14]。

3.2 蛋白质标记

作为生化遗传标记之一,蛋白质标记与同工酶标记的不同点在于其主要是从种子中提取蛋白质,主要检测醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白和谷蛋白等贮藏蛋白质。梁明山等[15]对8个烟草品种的种子水溶蛋白进行鉴定,从得到它们的 SDS-PAGE和 IEF-PAGE电泳图谱分析,这种水溶蛋白标记具有分辨力高、重复性强的特性,不同品种的电泳图谱具有明显的差异,从而可以将其区别开来,认为种子水溶性蛋白图谱可作为烟草品种鉴定的蛋白质指纹图谱。卢江平等[16]采用 PAGE鉴别 8个烤烟品种,发现种子醇溶蛋白质和盐溶蛋白质的 SDS-PAGE能够清晰的将各品种分辨开来。

4 分子标记

遗传标记的发展经历了形态标记、细胞学标记、生化标记到分子标记的过程。分子标记通常指的是DNA分子标记,是 DNA水平上遗传多样性的直接反映,表现为核苷酸序列的差异即序列的多态性。其作用是在生物的基因组内或各染色体上提供基因的准确位置,为研究基因的结构、序列、功能及其遗传和变异规律提供基础资料。与其它三种遗传标记相比,分子标记不仅数量巨大,同时也不受环境因素的影响。分子标记可应用于分子标记辅助育种、遗传图谱构建、种质资源研究和目的基因定位的研究。目前,应用于烟草研究领域中的分子标记技术主要包括 RAPD(随机扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片断长度多态性)、SSR(简单系列重复)、ISSR(简单重复间序列标记)、SRAP(相关序列扩增多态性)等方法。

4.1 随机引物扩增DNA多态性标记的应用

RAPD(Random amplified polymorphic DNA)是以基因组DNA为模板,单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物,通过 PCR扩增产生不同大小的 DNA片段,用于检测DNA序列的多态性。目前对烟草品种的分子鉴定多基于这种标记技术。尽管 RAPD技术较为简单快捷,但由于引物较短,扩增结果容易受到实验条件的影响,重复性较差。

Coussirat[20]以 32个烟草品种为材料,用 160个随机引物对其分别进行 RAPD分析,结果发现其中有 9个引物扩增的 29条带可以显示出这些品种存在着多态性。许明辉等[21]用 235个不同的随机引物对来源于不同国家的 23个烤烟和晒晾烟品种的基因组进行了RAPD分子标记分析。235个引物中有25个可以扩增出多态性的产物,利用其中16个引物扩增出46条多态性带。从这些结果看来,烟草品种间能扩增出多态性的引物比例较低,平均每个引物扩增的多态性条带数仅3.2和2.9条。肖炳光等[22]以29个烤烟品种为材料,采用 RAPD标记技术对其分子指纹和遗传关系进行了研究。先用100个随机引物对10个不同烤烟品种进行RAPD标记分析,通过筛选得到18个随机引物。利用这些筛选得到的引物对 29个烤烟品种的基因组DNA进行扩增,最终得到29个品种的指纹图谱。通过这些图谱对照,可对不同烤烟品种进行鉴定。何川生等[23]利用RAPD标记技术对31个烤烟品种进行分析,结果表明这 31个烤烟品种间有明显差异,利用多个引物可将 31个材料鉴定出来。梁明山等[24]采用改进后的“ROSE法”提取10个烟草品种的基因组DNA,在重复性较好的RAPD标准分析条件下,检测了烟草10个品种材料基因组的多态性,结果表明其多态性达81.1%。各品种的扩增图谱差异明显,可以清晰区别,可作为各品种的 DNA指纹图谱。

4.2 扩增片段长度多态性标记的应用

AFLP(Amplifiedfragmentlength polymorphism)是基于限制性内切酶和 PCR技术分析遗传多态性而发展的一种标记方法,它是通过选择性扩增经限制性酶切过的基因组DNA,从而显示其片段长度多态性。AFLP技术主要表现在多态性强,能够分析基因组较大的材料,可在相对较短的时间内产生较多的标记,但技术难度相对 RAPD高。

Ren N等[25]利用 AFLP标记技术对 46个烟草栽培种和7个烟草野生种进行遗传多样性分析,结果表明,野生种的遗传多样性相比栽培种高。另外,多态性谱带显示,普通烟草栽培种中都共同具有N.sylvestris,N.tomentosif ormis或N.otophora的一个特征谱带,这表明普通烟草的起源与这 3个野生种有关。杨友才等[26]以10个烟草品种为材料,并建立一种适于烟草 AFLP银染技术的优化体系,以引物 EACT/M-CAC构建了烟草种质资源的 AFLP指纹图谱,所制得图谱扩增带多,多态性强,且质量好。另外利用这种AFLP银染分析技术,以4对引物检测到174个多态性位点,这相当于分析了174个有差异的性状。上述研究充分证实了 AFLP标记在烟草资源遗传亲缘关系分析中,不管是从每个引物扩增出的带数、具多态性带数还是多态性带的比例来看,AFLP标记比 RAPD标记更适合于烟草的多态性检测[27]。Luca Rossi等[28]利用 6对 AFLP引物组合,在 4个烟草品种 K326,TN90,TN86和Samsun中扩增出了33个多态性标记。这些多态性标记可以很容易地将上述几个品种区分开来。即使用 K326和 TN90调制后的烟叶作为材料,这些多态性标记仍可以将它们鉴别出来。

4.3 简单序列重复标记的应用

SSR(简单序列重复,又称微卫星标记,Simple sequence repeats)是基因组中短小的重复序列,重复单位极小,一般只含有 2～ 5个核苷酸,重复次数一般为 10～ 15次。由于基本单元重复次数不同,形成了SSR座位的多态性,而每个 SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列,因此可以根据两侧序列设计特异PCR引物来扩增 SSR序列,经凝胶电泳分离,可以显示不同个体在某个 SSR座位上的多态性。

Bindler等[29]首次报道了烟草的 SSR标记遗传图谱,总共282个SSR标记扩增的293个位点被定位到烟草的24个连锁群上。叶兰钦等[30]利用已经公布的烟草SSR标记信息,分析了云南省烟草品种的 SSR标记遗传多样性,并进一步探讨利用 SSR标记技术在烟草品种鉴定中的应用。他们通过对92对分布于烟草24个连锁群的 SSR标记引物进行筛选,发现有20对在这些品种之间存在多态性;并在20个SSR位点上共检测到52个等位基因,平均每对引物对应的等位基因数为 2.6个。根据SSR标记多态性计算了13个品种之间的遗传距离介于 0.0090～ 0.4286之间,平均距离为 0.2237,这说明这些云南省烟草品种间遗传差异较小。

4.4 简单重复序列间扩增的应用

ISSR(Inter simple sequence repeats),这是近年来分子标记技术发展中的新技术之一,是由 Zietli Ewics等率先开发出的一种标记技术。引物为锚定的微卫星 DNA,是在微卫星标记序列的3′端或5′端加上 2～4个随机核苷酸,由于在 PCR反应中锚定引物能使特定位点退火,进而导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间 DNA片段进行 PCR扩增。所扩增的ISSR区域的多个条带经凝胶电泳得以分辨,扩增谱带多为显性表现。

蔡利等[31]研究表明,ISSR比 RFLP,SSR,RAPD等分子标记的扩增产物多态性都要丰富,相比而言ISSR可提供更多基因组的信息。 ISSR引物比 RAPD引物更长,退火温度也更高,因此其稳定性和可重复性更佳。目前,ISSR标记技术多用于烟草亲缘关系的分析、遗传多样性的研究、遗传图谱的构建和性状基因的定位等方面。傅冰等[32]利用ISSR标记对25个烟草种质资源进行了遗传多样性的研究分析。他通过筛选50条 ISSR引物最终选取 10%的引物,对 25份不同烟草基因组的 DNA进行有效扩增,结果表明,其多态性比率达到76.0%。梁景霞等[33]应用 ISSR分子标记方法,对烟草属6个种共96份种质进行遗传多样性与亲缘关系分析。结果表明,多态性比率高达95.2%。同时显示这些材料遗传相似系数在 0.28～ 0.97之间,遗传多样性丰富。这表明烟草品种间的遗传基础相对狭窄,但种间的遗传差异相对较大。祁建民等[34]对3份烟草野生种和27份栽培种进行了 ISSR分子标记检测与聚类分析。从研究结果可以看出,采用ISSR分子标记可清晰地将烟草野生种及栽培种中的烤烟、晾烟、晒烟、白肋烟、香料烟根据其遗传差异分别聚在不同的类型中。同时可看出烟草野生种的遗传多态性是十分丰富的,但在烟草栽培种中遗传多态性相对较差,这反映了烟草栽培种的遗传基础较为狭窄。杨本超等[35]利用 ISSR标记分析了 24份烤烟材料的遗传多样性。从 100个ISSR引物中筛选出 10个引物,通过凝胶电泳检测出多态性比率为67.79%。利用 2个多态性好的 ISSR标记可以将这 24份烤烟材料区分开,每个品种都有各自独特的指纹图谱,这表明ISSR标记适于烟草品种鉴定和遗传多样性研究。肖炳光等[36]以含137个株系的烤烟 DH群体(G-28×NC2326)及其亲本为材料,构建了包括 11个 ISSR标记和 158个 RAPD标记、由 27个连锁群组成的烤烟分子标记遗传连锁图。

4.5 相关序列扩增多态性的应用

SRAP(Sequence related amplified polymorphism),是一种基于 PCR的新型标记技术,于 2001年由美国加州大学 Li与 Quiros两位博士在芸薹属作物上开发而来。这种标记是通过特异的双引物设计对基因的 ORFs的特定区域进行扩增,通常上游引物长 17 bp,下游引物长18 bp。上引物主要用于对外显子区域进行扩增,下引物用于特异扩增内含子区域、启动子区域。其原理是由于不同个体以及物种之间的内含子、启动子与间隔区长度存在差异,通过扩增会产生多态性[37]。

Budak等[38]采用 ISSR,SSR,RAPD和 SRAP等 4种标记技术,共用30条引物检测15份野牛草遗传多态性,结果发现只有 SRAP能将这 15种基因型区分开来。由此可见,相比 ISSR、SSR、RAPD,SRAP这种分子标记技术对检测亲缘关系、建立烟草指纹图谱更适合。梁景霞等[18]以10个烟草栽培品种为试验材料,设置烟草 SRAP-PCR反应体系的影响因子的梯度实验,筛选并建立了重复性、多态性佳的 SRAP-PCR反应条件。新型的 SRAP标记技术比起其它分子标记技术因使用较高的退火温度和较长的引物,具有扩增稳定、易测序等优点,进而可以提供更多的遗传信息。

5 问题与展望

在研究作物遗传多样性方面,传统的形态学标记、细胞学标记随着分子水平技术的不断提高将逐渐失去研究价值和地位,这些生理生化水平的研究工作存在着很大的局限性和低准确性。相反,高效、准确的分子标记具备广阔的发展前景。

我国烟草生产上以引进品种为主,品种普遍表现抗病性弱、适应能力差,影响了我国烟草产量与品质的提高。而部分国内选育的品种,大多在生产中表现一般,外观及内在质量、工艺性状等均存在不足。又由于常规育种周期长,盲目性大,不利于烟草品种的改良。而利用分子技术对烟草新品种进行遗传改良,将在烟草遗传育种研究中起到重要的作用。分子标记技术的出现,通过与常规传统育种结合,在很大程度上可缩短育种过程和提高育种效率。分子标记辅助选择(MAS)在现代育种中具有重要意义,是今后育种研究的发展方向,其在许多农作物上取得了较大的进展,在烟草育种方面也逐步成为研究热点。笔者认为可利用分子标记技术对烟草的遗传资源进行整理,研究目前国内品种和国外引进品种的遗传背景,减少育种盲目性。另外,对烟草的育性、抗性、生长发育、产量及其构成因素和品质等进行研究,在有关的染色体连锁群上找到相应的QTL位点,以便于进行分子标记辅助选择育种和基因的分离克隆。

这些高速发展并逐步成熟的分子标记技术对进一步确定烟草品种间的亲缘关系、构建烟草遗传图谱、建立烟草种质资源基因库、分子标记辅助的 QT L定位等有着明显的优势,同时也为不断繁育出产质优良、抗病性、抗逆性强的品种提供基础。因此,分子标记技术在烟草研究中的应用具有极重要的理论意义,在烟草育种的实践中具有指导性作用,同时分子标记技术仍旧存在着广阔的发展空间。

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