植物激素测定方法述评

鲁 哲,邹振华,路 婧,王若仲

(湖南农业大学植物激素与生长发育湖南省重点实验室,长沙 410128)

植物激素是植物体内合成的对植物生长发育有显著作用的微量物质。目前,植物激素有六大类,即生长素类 (Auxins)、赤霉素类 (GAs)、细胞分裂素类(CTKs)、脱落酸 (abscisicacid,ABA)、乙烯 (ethyne,ET H)和油菜素甾醇(Brassinosteroids,BR)[1]。植物激素作为植物体内的微量信号分子,调节植物几乎所有的生长发育过程。长期以来,植物激素与植物生长调节剂一直是生物学和农学领域的研究热点,其成果为农业科技进步做出了巨大的贡献。例如,各种植物生长调节剂的广泛使用,已成为实现农作物高产优质的重要措施之一,在推动“绿色革命”、大幅度提高作物产量和保证国家粮食安全方面发挥了不可替代的作用[2]。由于植物激素在植物体内含量极低(一般每克植物组织鲜样中的含量为 1～100 ng),易被光解、热解和氧化,因此,如何对微量植物激素进行简便、快速和准确的定量分析,一直是植物激素研究领域的难题之一。近年来,随着功能基因组学、代谢组学(metabolomics)等整体性“组学”方法的提出以及生物学研究对活细胞单分子行为测定的日益关注,对植物激素等重要代谢调节物的测定技术提出了更高的要求。同时植物激素的生理功能具有时空特异性,植物激素作用机理和信号转导等前沿领域更是迫切需要对微量植物样品的超微量植物激素进行高灵敏、原位、实时测定。研究植物激素在植物组织或细胞中的分布特点及消长规律,目前常采用化学手段对内源激素水平进行检测,但测定结果的准确性较差[3],而且无法对激素进行定位研究,因为许多激素引起的很多生理反应常发生在激素受体分布的细胞器内[2],因此对植物激素的高灵敏、高通量、原位实时测定新技术提出了迫切要求。

传统植物激素和植物生长调节剂测定方法主要有以早期简单的小麦胚芽鞘切段伸长法为代表的生物测定法[4]、以气相色谱法[5](Gas Chromatography,GC)和高效液相色谱法[6](High Performance Liquid Chromatography,HPLC)为代表的理化测定法,及以酶联免疫吸附法[7](Enzyme Linked Immune sorbent Assays,ELISA)为代表的免疫测定法。传统植物激素和植物生长调节剂测定方法各有优缺点,下面分别进行评述。

1 生物鉴定法

生物鉴定法是最早使用的激素测定方法,它是利用激素作用于植株组织或器官后产生生理生化上的变化,通过该变化的大小推算植物激素含量的一种方法。1928年,荷兰研究生 Fritz Went在研究燕麦胚芽鞘弯曲程度与琼脂中生长素浓度的关系时,发现二者呈正相关,这种测定法后来被称为燕麦测试法[8]。生物鉴定法虽然简单,对检测仪器要求不高,但是对样品纯度要求高,专一性和重复性较差,近年来已很少使用。但对于从大量人工合成的化合物中筛选植物生长调节剂,生物鉴定法仍然是一种有效的植物激素定性分析方法[9]。

2 光谱及色谱检测法

传统光谱法如比色法测定植物激素,由于专一性差,已较少使用[10]。利用荧光技术与其它方法结合进行光谱测定的新方法成为光谱法检测植物激素的主流方法。薛泉宏等[10]对以往的赤霉素荧光测定的方法进行了改进,该法适合于发酵液及固态产品中赤霉素的测定。光谱测定植物激素法近年鲜有报道。

色谱法是利用不同物质在不同相态的选择性分配,以流动相对固定相中的混合物进行洗脱,混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动,最终达到分离的效果。早期采用的色谱测定方法主要是纸层析(Paper Chromatography,PPC)和薄层层析 (Thin Layer Chromatography,TLC),先将植物样品通过层析进行分配再通过显色等方法进行鉴定。这两种方法操作简便,所需设备简单,但是分离效率和灵敏度有限,因而现在已很少单独使用。将薄层层析与高效液相色谱(HPLC)和酶联免疫吸附法(ELISA)等检测技术相结合可以有效地提高检测的灵敏度。如李兆亮[11]等先用薄层层析纯化样品,然后利用 HPLC定量分析植物叶片中的水杨酸的含量,获得了较理想的结果。

气相色谱和高效液相色谱是 20世纪 60年代开始应用于激素测定的技术,现在已经成为植物激素检测的主要方法。气相色谱法是指以气体为流动相的色谱法。气相色谱分析速度快,可用于分析测定所有的植物激素,但前提是待测激素必须形成易挥发的衍生物。大部分植物激素都含有极性基团,沸点较高,因此在进行GC分析前必须制备成为合适的挥发性衍生物[12]。已有一些衍生化方法被应用于植物激素分析。如张有林等[13]用溴甲基五氟苯对 ABA和IAA进行衍生、酯化,在气相色谱柱上分离效果良好,对电子检测器反应敏感,ABA和 IAA的最小检测限各为 10-12g/mL和10-13g/mL。乙烯是以气态存在的植物激素,因而可以不经过衍生化直接用GC测定[14]。此外,杜黎明等建立了一种530μ m大口径毛细管气相色谱测定法,可以不经衍生化处理,直接进样[15]。 HPLC可用于除乙烯外的所有植物激素的分析检测,其结果准确性和灵敏度较高,且与 GC相比前处理简单,对所测激素结构无破坏,因此已经成为植物激素测定的一种常用方法。HPLC可以选用不同的检测器,如荧光检测器[16]、紫外检测器[17]等。其中紫外检测器是一种较为常用的检测方法。

由于 HPLC和 GC在测定过程中对保留时间的分辨有一定限制,若前处理过程达不到所需纯度要求可能会出现几种化合物的保留时间相同或接近而影响测定结果的准确性。将质谱(Mass Spectrography,MS)技术与 HPLC或 GC联合使用[18～21],可以有效地提高检测的选择性和灵敏度,因此仪器联用是目前植物激素测定技术的发展趋势。

3 传统免疫检测法

放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和酶联免疫法(ELISA)是植物激素免疫测定传统方法。放射免疫方法具有较高的灵敏度,但需要特殊的操作技术和实验室设备,不适于作为常规检测方法。相对而言,酶联免疫吸附分析方法[22]应用更为广泛。但ELISA在灵敏度上还不能完全满足实际样品检测的需要。因此开发间接的 ELISA法检测 GA3,利用 GA3～ GA7免疫家兔得到的抗血清,建立了检测结合态 GA3的间接酶联免疫吸附测定方法。免疫抗原与包被抗原用最常见的 DCC活化羧基与蛋白质相联,检测极限为 12.3 ng/m L,线性范围 12.3～ 1 000 ng/mL。抗血清与 GA3的交叉反应率为 2.3%,与 GA,IAA,ABA和 zR的交叉反应率均很小[23]。随着 ELISA技术的发展,利用该技术测定各类农作物中植物激素在代谢中作用的实例日渐增多[24～27],并且获得了稳定的结果。近期,有报道运用免疫层析技术和液相电喷雾质谱法结合的 ABA检测方法,利用样品在免疫层析凝胶的高专一性和灵敏度使其成为一种新型方便、高效和灵敏的分离纯化方法[28]。

气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用 (GC/MS)或液-质联用(LC/MS)、酶联免疫分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)等方法各有优点,但都存在操作繁冗、灵敏度不佳、结果重复性差、仪器昂贵或者易出现假阳性结果等缺陷。因此,开发高灵敏、简单、快速的用于植物激素检测的方法非常紧迫。

4 生物传感器检测法

生物传感器(biosensor)技术是将生物所具有的特性和电子装置相结合的一种技术,利用生物间特异的亲和作用将信号转换成能够被识别的装置。生物传感器具有快速、实时、高度特异性和高灵敏度等优点,能够制备成用于快速现场检测的装置[29]。按分子识别元件将生物传感器分为酶传感器、免疫(抗原或抗体)传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞器传感器、核酸传感器、分子印迹传感器等[30]。

生物传感器还存在一定的局限性,如使用寿命、长期的稳定性、批量生产工艺等都是生物传感器研究、应用和产业化亟待解决的。但是针对植物激素这样一种极其不稳定的物质,相比以往各种传统方法,应用生物传感器测定植物激素含量,不但精确、高灵敏,而且具有操作简单、快速、廉价、轻巧等优点,因而是一种具有发展前景的植物激素测定方法。

近年来,利用生物传感器技术针对植物激素的检测有了很大进步。利用电化学生物传感器方法检测植物激素的方法逐年增多[31,32]。近年来,湖南省植物激素与生长发育重点实验室,在压电免疫传感器、电化学传感器及光学生物传感器检测植物激素方面有一定突破,是植物激素测定领域的又一拓展[33～36]。电化学传感器和光学生物传感器是微型化生物传感器测定植物激素技术的必然发展趋势。

5 非损伤微测定技术

非损伤微测技术 (NoninvasiveMicrotest Technique,NMT)起源于美国 Marine Biology Laboratory(MBL)实验室。 1990年 MBL的科学家Kǜ htreiber使用非损伤微电极测量了进出细胞的Ca2+流速和运动方向,开创了生物活体静态测量到动态测量转变的先河[37]。 1995年 MBL的科学家在《Nature》发表文章阐明了非损伤微测技术的数学、物理学基础以及应用方式,进一步完善了非损伤微测技术,从此非损伤微测技术进入各研究领域并发挥着越来越重要的作用[38]。 2010年8月,普渡大学的科学家发展了一种用碳纳米管技术研制的生长素(IAA)微电极,结合非损伤微测技术测定了玉米株系 B73和突变体 Br2中IAA的分布和运输[39]。研究表明,非损伤微测技术与信号解耦联、整合流速相结合,利用菲克第一定律,可测定玉米根中内源性IAA的流速。该研究使用非损伤微测技术实时地测定了根表面的 IAA流速,可为研究生长素的极性运输,感受重力,研究活体植物根的发育和幼苗的调控机制提供重要帮助。

6 展 望

植物激素对植物生长发育及代谢有重要作用,对其进行准确、快速、高灵敏、高通量、原位实时定量测定成为一项必然的工作。传统植物激素和植物生长调节剂测定方法各有优缺点,以高效液相色谱法为代表的理化检测法依然是现今植物激素检测的主流,但是多与仪器联用进行检测,检测成本较高。随着生物传感器法对植物激素测定的日益完善,可以达到实时快速测定、检测成本不高,进一步解决原位检测的困难,其将有很大的发展空间。非损伤微测技术在生物微传感器方面的应用,值得密切关注。非损伤微测技术,其优势在于对植物无损伤,原位实时进行植物激素的检测,有较为广阔的应用前景,但目前因为技术原因,对测定痕量植物激素方法有待进一步提高。将非损伤微测技术与生物传感器联合应用于对植物激素检测将是未来植物激素检测的必然趋势。

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