雨生红球藻紫外诱变及抗铵品系筛选3

张 丽,范鸣浩,宋益民,张学成

(1.青岛科技大学化工学院,山东青岛266042;2.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)

雨生红球藻紫外诱变及抗铵品系筛选3

张 丽1,2,范鸣浩1,2,宋益民1,2,张学成233

(1.青岛科技大学化工学院,山东青岛266042;2.中国海洋大学海洋生命学院,山东青岛266003)

经紫外诱变,筛选出在碳酸氢铵浓度为400 mg/L条件下可以生存的突变株。通过培养基中氮、磷、铁、温度、光照及p H值对雨生红球藻诱变株生长的影响进行比较,对以上3种营养盐及3种环境因子分别进行三因素三水平正交实验,以优化培养条件。进而对雨生红球藻野生型及诱变株的生长状况及色素含量进行比较。实验结果表明,雨生红球藻抗铵品系在培养基中NaNO30.1 g/L,KH2PO40.01 g/L,FeCl3·6H2O 1.0 mg/L,在p H值为8.0,光照强度100μmol· m-2·s-1,温度为18℃的培养条件下,雨生红球藻的生物量得到有效提高。

雨生红球藻;紫外线;诱变;碳酸氢铵;正交实验

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)属绿藻门团藻目红球藻科[1],在适宜条件下,以绿色游动细胞形式存在,在胁迫条件下,如氮缺乏、高光强及盐胁迫条件下,绿色游动细胞失去游动能力,变为厚壁的不动细胞并积累大量虾青素(Astaxanthin)[2]。虾青素是良好的着色剂并具有超强的抗氧化、抗癌变、抗紫外线辐射及增强免疫等功能,在医药、食品、化妆品和水产饵料等领域有广泛的用途[324]。雨生红球藻中虾青素含量可达藻体干重的2%～4%[5],为微生物中类胡萝卜素含量的10～50倍,被公认为自然界中天然虾青素含量最高的生物,是用来获取天然虾青素的理想材料[6]。规模化培养雨生红球藻是获取天然虾青素的最佳途径,因此,近几年来关于雨生红球藻的品系选育、培养条件优化和大规模养殖成为微藻领域的研究热点之一。

但是,雨生红球藻养殖过程中,轮虫、纤毛虫等原生动物及其他微型藻类都严重地影响雨生红球藻生长繁殖,生物污染防治成为该藻规模化培养所面临的问题。早期实验表明,开放式培养过程中,大约4～5 d培养液中就会出现吞食雨生红球藻的轮虫,随后导致整个培养失败[7]。目前,用于抑制或杀灭敌害生物的药物有化学药品和中草药两大类[8],许多生产单位都进行过使用药物杀灭藻液中敌害生物的试验,但往往由于敌害生物对药物的抵抗力比培养藻类强,效果多不理想。董美斌[9]等研究发现,当培养基中碳铵浓度为250 mg/L时,24 h内轮虫数量下降到0。

本文首次通过紫外线照射野生型雨生红球藻,获得可以在含有较高碳铵浓度的培养基中生存的突变株,并通过对培养温度、光照强度、p H值,以及氮、磷、铁的浓度等参数对诱变株生长的影响进行研究,为雨生红球藻的大规模培养提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 藻种

雨生红球藻(Heamatococcus pluvialis),保存于中国海洋大学藻类遗传实验室。

1.2 培养基

基本培养基组成为(g/L):NaNO30.5,KH2PO40.02,MgSO40.1,CaCl20.08,Fe2EDTA 100μL/L(EDTA ·2Na 3.72 g/L,FeCl3·6H2O 4.17 g/L),微量元素100 μL/L(H3PO412.37 mg/L,MnSO4·H2O 84.51 mg/L, ZnSO471.89 mg/L,CuSO4·5H2O 62.42 mg/L,Na2MoO4·2H2O 7.26 mg/L,CoCl2·2H2O 4.76 mg/L, NiCl28.10 mg/L)。固体培养基为:液体培养基中加入1.5%的琼脂。正交实验根据实验需要调整氮、磷及铁盐的浓度。

1.3 培养条件

光源为日光灯,光照60μmol·m-2·s-1,光暗周期为12 h/12 h,温度(22±1)℃。100 mL三角瓶,每瓶培养液的体积为50 mL。取对数生长期的藻以1∶5的比例接种,每天摇瓶3次。正交实验根据实验需要改变光照强度及温度。

1.4 诱变方法及有效剂量

1.4.1 诱变方法 取对数期的雨生红球藻藻液10 mL,5 000 r/min离心5 min,弃上清,用新鲜配制的培养液重新悬浮。取200μL藻液涂布在固体培养基上,30 W紫外灯20 cm处照射。照射时间为1、2、3、4、5、6、7及8 min,每种剂量做6个重复,未照射为对照。照射后避光放置12 h,之后于适宜条件下培养。

1.4.2 致死率计算 10 d后对平板上长出的藻落进行计数,按下面公式计算致死率:致死率=(1-处理组藻落数/对照组藻落数)×100%。根据照射时间和致死率曲线确定适宜的诱变时间[10]。

1.5 测定指标及测定方法

1.5.1 藻细胞密度的测定 使用UV22102PC型紫外2可见分光光度计测藻液在680 nm波长的吸光度,用血球计数板测定对数期的藻细胞密度。取一定量的藻液,用血球计数板计数得出细胞密度,测定所取藻液在680 nm处的吸光度,稀释不同倍数所测定的值可做出细胞密度与吸光度的标准曲线。

1.5.2 生长速率的测定 特定生长率SGR=(lgNtlgN0)×100%/t,其中SGR为特定生长速率,t为培养时间,N0为初始OD值,Nt为培养t天后藻细胞的OD值[11]。

1.5.3 p H值的测定 用Orion Model 828型酸度计测定。

1.5.4 碳铵对雨生红球藻的致死率 设固体培养基中碳铵的浓度为100、200、400、600及800 mg/L,将对数期雨生红球藻涂布于平板上,10 d后对平板上长出的藻落进行计数,重复3次,致死率计算方法同1.4.2。

1.6 突变株的筛选

将诱变后平板上长出的体积较大的藻落挑取至含有5 mL液体培养基的试管中培养10 d。在固体培养基中加入NH4HCO3,浓度为400 mg/L,将诱变后试管中的藻液涂布在固体培养基上,10 d后平板上长出的藻落即为目标突变株。将藻落挑至试管中培养,光照60μmol·m-2·s-1,光暗周期为12 h/12 h,温度(22±1)℃,待长成后,分别接种到100 mL的三角瓶培养。培养15 d,每48 h测定生长速率,选取生长速率快的藻株。

1.7 正交实验设计

以原始培养基为基础,营养盐三因素各取3个水平,即NaNO3浓度为0.1,0.5及0.9 g/L,KH2PO4浓度为0.01,0.05及0.1 g/L,FeCl3·6H2O浓度为1.0, 3.0及5.0 mg/L,环境因子三因素各取3个水平,培养温度为18,24及30℃,光照为10,30及100μmol· m-2·s-1,p H为6,8,10,利用L943的正交设计表进行实验,以确定各因素对特定生长速率影响的显著性和最佳组合。每隔48 h调1次培养基的pH值,培养的初始OD680为0.02,培养15 d。每组做3个平行,重复1次。

1.8 雨生红球藻野生型及诱变株的生长情况及色素含量

1.8.1 生长情况的测定 活化2个藻种7 d,使其维持在对数生长期,生长状态良好,将2种品系藻液的藻细胞密度调节为一致。250 mL三角瓶,100 mL培养基,取20 mL藻液接种,测量光密度,两品系藻细胞初始密度都为0.02,培养20 d,48 h测一次细胞密度,3个平行,重复1次。

1.8.2 光合色素的测定 采用Arnon法进行测定。取1 mL藻液,5 000 r/min离心5 min,去上清,加入90%丙酮1 mL,震荡提取,重复3次,收集上清,分别在663、646及470 nm波长下测吸光度,90%丙酮为空白。叶绿素a、叶绿素b及类胡萝卜素的含量用以下公式计算:

Ca=12.21OD663-2.81OD646;

Cb=20.13OD646-5.03OD663;

Cx·c=(1000OD470-3.27Ca-104Cb)/229。

其中,Ca为叶绿素a的浓度,Cb为叶绿素b的浓度,Cx·c为类胡萝卜素的总浓度(mg/L)。

2 结果与分析

2.1 紫外线照射的剂量效应

经紫外线照射后,藻细胞的形态及运动能力发生了不同程度的变化。死亡细胞胞内空间消失,原生质体结构发散,呈浅绿色。随着诱变处理时间延长,照射时间从1 min延长到5 min,雨生红球藻细胞致死率随着时间的延长而提高,有明显致死效应。照射时间为3 min时,致死率为26.4%,处理5 min时致死率达到84.6%。将存活细胞挑入液体培养基中培养24 h进行观察,大多细胞缓慢转动,少数局部摆动。诱变处理时间再延长,致死率增加缓慢,照射时间为8 min时,致死率为98.4%。实验中采用5 min对雨生红球藻进行诱变处理。

图1 紫外线照射时间对雨生红球藻的致死效应曲线Fig.1 The curve ofH.pluvialisexposure time to ultraviolet and the lethal effect

2.2 细胞密度与OD680关系曲线

由图2可以看出,对数期的雨生红球藻细胞密度与OD680值基本成正比,经回归分析,藻细胞密度与OD680之间呈线性关系,回归方程为:y=0.125 8x+ 0.011 1,相关系数R2=0.995 2>0.735[12],说明相关关系显著。所以只要测得吸光度,就可以直接求得藻细胞的生物量,从而大大简化生物量的测定方法。

图2 雨生红球藻细胞密度与OD680值的线性关系Fig.2 The lineal relationship between cell density of H.pluvialisand OD680values

2.3 抗铵品系的筛选以及碳铵对雨生红球藻野生型及诱变株的致死率

紫外线照射后,在含有浓度为400 mg/L的NH4HCO3的固体培养基上长出极少的藻落,挑选个体大的藻落于试管中培养,待其长成后观察,少数有贴壁及沉淀现象,目测挑选几株生长状况好的藻株进行测定,生长情况如下:雨生红球藻诱变株19号的终细胞密度小于野生型,诱变株3号,7号及45号的终细胞密度大于野生型,与野生型出发株相比,诱变株3号生物量增长了4.0%,7号增长了13.9%,而45号的藻细胞终浓度增长了28.7%。由此可看出诱变株45号生长最快,而且其不贴壁,无沉底现象,将其视为本文的目标藻株,并进一步测定(下文中所出现的诱变株均为诱变株45号)。

图3 野生型及各诱变株的生长情况比较Fig.3 The comparison of cell growth of wild type and mutant strain

碳铵对雨生红球藻野生型及诱变株的致死率的实验结果如图4所示,培养基中N H4HCO3的浓度为200 mg/L时,野生型雨生红球藻有一半的藻细胞死亡,突变株仅有1.85%的细胞死亡,死亡细胞质壁间隙消失,呈浅绿色球形,失去鞭毛。当N H4HCO3的浓度为400 mg/L时,野生型死亡率达到88%,而突变株为21.5%。

根据文献中所阐述的[9],当NH4HCO3的浓度为250 mg/L时,24 h内轮虫数量下降至0。由此,雨生红球藻突变株在培养基中NH4HCO3的浓度为250 mg/L时可以存活,且能避免轮虫等水生生物的影响。

图4 不同浓度的NH4HCO3对雨生红球藻野生型及突变株的致死率Fig.4 The mortality of NH4HCO3at different concentrations on the growth of wild type and mutant strain ofH.pluvialis

2.4 雨生红球藻抗铵品系培养基初步优化

对雨生红球藻培养基进行考察,培养基中的硝酸盐、磷酸盐、FeCl3·6H2O以及环境因素对雨生红球藻的生长均有一定的影响,所以选择培养基中提供这3种营养元素的营养物质进行浓度的优化,为进一步精简实验步骤,增加实验的分析性,初步优化采用正交试验法,结果如下列各表。

2.4.1 营养盐的正交实验 从表1的计算结果可以看出,藻细胞极差r值为Na2NO3>KH2PO4>FeCl3· 6H2O,可见Na2NO3对藻细胞生长影响最大,KH2PO4影响次之,FeCl3·6H2O浓度影响最小。不同的培养基组合中雨生红球藻诱变株的特定生长率也有一定的差别,由表1可以看出培养基中营养盐优化组合为: NaNO3=100 mg/L,KH2PO4=10 mg/L,FeCl3· 6H2O=1.0 mg/L(其他同基本培养基),在优化后的培养条件下,藻细胞培养15 d后生物量比在原始培养基中提高了19%。

由表2藻细胞特定生长速率方差分析可知:培养基中NaNO3对藻细胞生长影响最为显著,KH2PO4影响显著,FeCl3·6H2O影响不显著。3个因素的F比分别为34.250、11.625、1.000,则NaNO3对藻细胞生长影响最大,KH2PO4次之,FeCl3·6H2O影响最小,与极差分析一致。

表1 NaNO3,KH2PO4和FeCl3·6H2O对诱变株藻细胞特定生长率影响的正交试验设计及极差分析Table 1 Range analysis of mutant strain alga cell specific growth rat effected by NaNO3,KH2PO4and FeCl3·6H2O

表2 NaNO3,KH2PO4和FeCl3·6H2O对诱变株藻细胞特定生长速率的方差分析Table 2 Variance analysis of mutant strain alga cell specific growth rate effected by NaNO3,KH2PO4and FeCl3·6H2O

2.4.2 环境因子正交实验 由表3极差分析可知,对雨生红球藻诱变株生长而言:p H、光照强度、温度极差分别为0.210、3.580和0.227。光照强度对雨生红球藻诱变株的生长影响最大,温度次之,p H值影响最小。不同的组合中藻细胞特定生长率SGR的差别很大,组合7中SGR为3.66,而组合6中的SGR达到8.49。从藻细胞的特定生长率SGR可知生长环境条件温度为18℃,光照强度为100μmol·m-2·s-1,pH值为8。

表3 温度、光照强度和p H值对诱变株藻细胞特定生长率正交试验设计及极差分析Table 3 Range analysis of mutant strain alga cell specific growth rate effected by temperature,light and p H value

由表4藻细胞特定生长速率方差分析可知:光照强度对雨生红球藻诱变株的生长影响极显著,温度的影响显著,而培养基的p H值影响不显著。3个因素的F比分别为1.000、270.887、47.507,则光照强度对藻细胞生长影响最显著,温度次之,p H影响最小,与极差分析一致。

表4 温度、光照和p H值对诱变株藻细胞特定生长速率的方差分析Table 4 Variance analysis of mutant strain alga cell specific growth rate effected by temperature,light and p H value

2.5 雨生红球藻野生型及诱变株的生长情况及色素含量

2.5.1 雨生红球藻野生型及诱变株的生长状况比较在相同培养条件下,诱变株藻细胞的终细胞密度明显增加了,由图5可以看出,雨生红球藻诱变株抗铵品系的细胞密度远大于野生型,培养至第20 d,诱变株的终细胞密度比野生型增加了36.9%。

图5 野生型与诱变株生长状况比较Fig.5 The comparison of cell growth of wild type and mutant strain

2.5.2 光合色素的含量 雨生红球藻的光合色素主要是叶绿素a、b和类胡萝卜素。叶绿素a广泛地存在于所有绿色植物的叶绿体中,是类囊体膜的主要色素,叶绿素b是另一种重要色素,它总是伴随叶绿素a存在于高等植物和绿藻中。研究发现,紫外线辐射对藻液中叶绿素和类胡萝卜素含量有降低作用,随着辐射时间的延长,含量下降越快,相反,藻细胞中叶绿素和类胡萝卜素含量全部上升,随辐射时间的延长,上升幅度增加,在辐射5 min后,甚至增加了好几倍。

图6 野生型与诱变株的光合色素含量Fig.6 Photosynthetic pigment content of wild type and mutant strain

由图6可以看出,诱变株的叶绿素a,叶绿素b及类胡萝卜素的含量均大于野生型雨生红球藻。叶绿素a/叶绿素b反映捕光色素复合体Ⅱ(L HCⅡ)在所有含叶绿素的结构中所占比例,该比值高说明捕光能力强,由此可以推断,诱变株的光和效率要大于野生型雨生红球藻。

3 讨论与结论

氮是雨生红球藻生长过程中的必需营养元素。在对雨生红球藻生长的适宜氮浓度的研究中,Borowitz2 ka[13]等得出浓度范围为0.5～1 g/L的硝酸钾对雨生红球藻生长更有利,Gong[14]等报道0.51 g/L的硝酸钠为雨生红球藻生长适宜的氮浓度,Fabregas[15]等实验得出4 mmol/L左右的氮浓度是最有利雨生红球藻生长,都与Borowitzka等的结果接近。而Orosa[16]等得出0.15 g/L的硝酸钠才是雨生红球藻生长的最适氮浓度,翟兴文[17]等研究报道硝酸钾的适宜浓度是1 g/L,各种结果都相差甚远。

Borowitzka[13]等认为尽管磷对雨生红球藻的生长是必不可少的,但不同浓度的作用效果差异并不明显,翟兴文[17]等研究报道磷酸二氢钾浓度为0.02～0.04 g/L时是适宜雨生红球藻生长的。

铁是人们最早发现的微量元素,在原核生物和真核生物的生命活动中具有不可替代的功能,位居植物必需微量元素的首位[18]。在浮游植物的生长过程中,电子传递,氧的新陈代谢,氮的吸收利用,叶绿素的光合作用,呼吸作用等都受铁的影响。单因子实验表明较高浓度的FeCl3·6H2O对藻的生长有促进作用,但正交实验结果却相反,这可能是各因子间相互影响的结果。

光照是影响雨生红球藻生长的重要因素之一。Boussiba[19]等认为雨生红球藻适宜生长的光强较弱,范围在30～90μmol·m-2·s-1之间。近几年,不同研究者对雨生红球藻生长的最适光强的看法差别很大,在雨生红球藻研究的实验中采用的光强也多种多样。本实验得出的结论是光照强度100μmol·m-2·s-1时藻细胞生长最快,但是这不利于藻细胞的高密度积累,因为高光强会诱导虾青素的产生,培养至17 d时会出现红色厚壁细胞。

Hata[20]等认为,雨生红球藻最适生长的p H值为中性至微碱性。张宝玉等[21]研究了4株雨生红球藻,得出它们的最适的p H值多数在7.0～8.0的范围内,与本实验的结果相近。

实验证明,雨生红球藻诱变株可以在含有NH4HCO3浓度为400 mg/L的培养基中存活,且生长速度较原始株有所提高,培养20 d后生物量比出发株提高了36.9%,色素含量较野生型也有一定提高。诱变株初步优化后的培养条件为:NaNO30.1 g/L,KH2PO40.01 g/L,FeCl3·6H2O 1.0 mg/L,p H=8.0,光照强度100μmol·m-2·s-1,温度18℃。

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UV Mutagenesis and Anti2Ammonium Strain Selection of Haematococcus pluvialis

ZHANG Li1,2,FAN Ming2Hao1,2,SONG Yi2Min1,2,ZHANG Xue2Cheng2
(1.College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China;2.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

AHaematococcus pluvialisstrain that can stands in 400 mg/L NH4HCO3was obtained by UV mutagenesis and selection.In order to determine the optimal cultural conditions,effects of nutrition ele2 ments(nitrate,phosphate and ferric)and other ecological elements(p H value,temperature and light in2 tensity)on the growth ofHeamatococcus pluvialisof mutant strains,and orthogonal tests with three ele2 ments and three levels were conducted.Also,the cell growth and photosynthetic pigment content of wild type and mutant strain were compared.Results uncovered that the optimal culture conditions of mutant strain were determined as follows:NaNO3,KH2PO4and FeCl3·6H2O concentrations 0.1 g/L,0.01 g/L and 0.001 g/L,respectively,and p H8.0,light intensity 100μmol·m-2·s-1and temperature 18℃. Under these conditions,the biomass ofHeamatococcus pluvialisincreased remarkably.

Heamatococcus pluvialis;ultraviolet;mutagenesis;strain selection;orthogonal tests

book=2011,ebook=6

S948.8

A

167225174(2011)062068207

责任编辑 于 卫

国家自然科学基金项目(30471317)资助

2010203210;

2010209213

张 丽(19852),女,硕士生。E2mail:swing_lily@hotmail.com

33通讯作者:E2mail:xczhang@ouc.edu.cn