2010年北京市延庆县首批流感病例样的实验室病原学检测

北京市延庆县疾病预防控制中心（102100）崔玉娟 任淑敏 苏东霞

2010年11月2日，北京市延庆县某小学出现了15例不明原因发热症状儿童病患，主要临床症状为发热（体温37.5℃以上）、咳嗽等。为查明疫情原因、制定有效的防治措施，及时控制、扑灭疫情并提供可靠的实验室数据，本县疾病预防控制中心应用实时荧光定量PCR技术对患者的咽拭子标本进行了甲型流感病毒、乙型流感病毒、甲1型流感病毒、甲3型流感病毒、甲型H1N1流感病毒等亚型检测。

1 材料与方法

1.1 样本采集 用带有无菌聚丙烯纤维头及聚丙烯杆的拭子采集发病3天内的病例咽拭子12份，于4℃保存下运送到实验室进行检测。

1.2 主要试剂与仪器 QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit、AgPath-IDTm onestep RT-PCR Kit（美国ABI公司）、引物（fluA、fluB、H1、H3、swfluA、swH1、RNP由北京市CDC 提供）、QIAGENQIAvac 24 Plus（德国QIAGEN公司）、离心机（德国Sigma公司）、生物安全柜（上海东联）、AB 7500 fast PCR System（美国ABI公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样本预处理 将12份咽拭子在涡旋振荡器上充分震荡混匀，室温静置10min。

1.3.2 核酸提取 分别取200μl预处理好的标本依照QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒说明书进行核酸提取，最后分别得到60μl样本核酸作为扩增模板。

1.3.3 核酸扩增 按照ABI公司的AgPath-IDTm one-step RTPCR Kit试剂盒说明书对12份核酸样本进行real-time RT-PCR扩增。选择FAM荧光检测模式。

1.3.4 结果判断 阴性对照：无扩增曲线，无CT值或0。阳性对照：有扩增曲线，CT值＜30。检测样本：样本有典型的扩增曲线且CT值≤37，报告样本阳性。见附表1。

2 结果

12份病例样本完成PCR扩增后，其扩增曲线显示：8份样本为fluA、RNP及H3同时阳性，1份样本七种引物探针核酸扩增均阴性，3份样本仅RNP引物探针核酸扩增阳性。见附表2、附图。

3 讨论

Real-time RT-PCR是将荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET） 应用于常规PCR仪中，通过受体发色团之间偶极与偶极相互作用，能量从供体发色团转移到受体发色团，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA或RNA产量成正比，检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的[1][2]。实时荧光定量PCR技术于1995年由美国PE公司推出后，Heid[3]等首先就其原理方法进行了报道。该方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、PCR污染少、快速简洁、自动化程度高等优点[4]，可在3～4h内得到扩增结果。目前已在动植物基因工程、微生物和医学领域中得到广泛应用[5]，已经成为基层实验室快速检验的重要手段。

附表1 结果判断原则

附表2 12份病例样本PCR扩增结果

附图 12份样本的real time RT-RCR扩增曲线

在流感样的实验室病原学检测中，本研究利用fluA、fluB、H1、H3、swfluA、swH1等6种引物探针来实现对流感的分型分析。研究中还引入RNP引物探针作为内标，检测人细胞中的RnaseP基因，从而判断样本采集及核酸提取是否合格。只有在采集的样本合格的前提下，才能进一步分析得知。12份病例样本的核酸扩增结果显示，1号样本RNP扩增结果为阴性，说明这份样本并未采集到患者的咽部上皮细胞，为无意标本。因此，不能说明1号病例是否为流感病例。

同一起聚集性疫情中，病例的临床症状相似，理论上其样本的实验室病原学检测结果应该一致，但实际上有时会有差异。跟样本采集的质量有关，若没有采集到病例的咽部上皮细胞，则会得到阴性检测结果；跟采样的时间也有密切的关系，应在病例发病后尽早采集，一般采集发病3日内的标本。此外，由于RNA不稳定，极易降解，采集到的标本应在4℃下立即送达实验室检测，如不能立即检测的标本应在-20℃或-80℃下冷冻保存。临床标本运输和储存过程中应避免反复冻融，若标本运输保存不当，则会影响检测结果的准确性。扩增试剂的灵敏度也是影响检测结果的一个重要因素，不同的检测试剂盒其引物探针的灵敏度不同，最后所得到的检测结果也会有一定差别。