银杏达莫注射液对高钾血症大鼠离体血管张力的影响*

包鹏举， 戚仁斌， 王海华△， 张根葆， 胡钱国， 孙 瑶

(皖南医学院 1生理教研室，2蛇毒研究所，安徽 芜湖 241002；3暨南大学医学院病理生理学教研室，广东 广州 510532)

银杏达莫注射液对高钾血症大鼠离体血管张力的影响*

包鹏举1,2， 戚仁斌3， 王海华1,2△， 张根葆2， 胡钱国1,2， 孙 瑶2

(皖南医学院1生理教研室，2蛇毒研究所，安徽 芜湖 241002；3暨南大学医学院病理生理学教研室，广东 广州 510532)

目的观察银杏达莫注射液(GD)对高钾血症大鼠离体胸主动脉的影响，并探讨其可能作用机制。方法复制高钾血症大鼠模型，制备离体胸主动脉环，经生物信号与采集分析系统测定主动脉环的张力变化。观察不同浓度GD(4、8、16 mg/L)预孵育的高钾血症大鼠胸主动脉血管环对去氧肾上腺素(PE)和KCl收缩张力的影响。结果与正常大鼠相比，高钾血症大鼠胸主动脉环对PE和KCl收缩张力明显升高(P<0.05)。不同浓度GD对基础张力无明显影响(P>0.05)。在内皮完整主动脉环上，GD预孵育后对KCl收缩张力无明显影响(P>0.05)；而16 mg/L GD预孵育后对PE收缩张力有明显抑制作用(P<0.05)，此作用可被一氧化氮合酶抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)或鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝(MB)所抑制。在去内皮的主动脉环上，不同浓度GD预孵育后对PE收缩张力无显著作用(P>0.05)。结论GD对高钾血症大鼠胸主动脉环具有内皮依赖性舒张作用，其机制可能与激活血管内皮细胞一氧化氮-鸟苷酸环化酶途径有关。

银杏叶提取物; 双嘧达莫； 高钾血症； 主动脉

高钾血症是慢性肾功能衰竭和糖尿病酮症酸中毒等临床疾病常见且危重的并发症之一，若不及时处理则会加重血管病变(内皮损伤等)和心肌毒性而危及生命[1,2]。银杏达莫注射液(Ginkgoleaf extract and dipyridamole injection,GD)为我国第4代银杏叶提取物加入双嘧达莫的复合制剂，临床上因其具有保护血管内皮细胞、调节血管张力、改善机体代谢及末梢血液循环障碍等作用而主要用于治疗血管性痴呆、脑梗死、糖尿病肾病、糖尿病神经病变等疾病[3-5]。然而，目前关于银杏达莫注射液对高钾血症离体血管的直接作用尚缺乏研究，其机制亦尚未明了。本实验采用大鼠离体胸主动脉环灌流方法，观察银杏达莫注射液对高钾血症大鼠离体胸主动脉环张力的影响，并探讨其可能作用机制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物 清洁级Sprague-Dawley大鼠，雌雄不限，体重(220±30)g，由皖南医学院实验动物中心提供，实验动物合格证号为SCXK(浙)20080033。

1.2主要试剂和仪器 银杏达莫注射液为贵州益佰药厂产品，规格：安瓿瓶包装，5 mL/瓶。批号为20081104。去氧肾上腺素(phenylephrine，PE)、乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)、左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)、亚甲蓝(methylene blue，MB)均为Sigma产品。Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol·L-1)：NaCl 118、KCl 4.7、KH2PO41.2、MgSO41.2、NaHCO325、glucose 5.5、CaCl22.5。离体血管环灌流装置和Medlab/8C生物信号采集系统购自南京美易科技公司；张力传感器(JZ101型)购自河北高碑店市新航机电设备有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

2方法

2.1高钾血症动物模型 参照董雅洁等[6]模型复制方法，大鼠称重后用20%氨基甲酸乙酯溶液(6 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定在大鼠手术台上。用针型心电电极分别插入大鼠四肢皮下，导联线输入端接入Medlab/8C生物信号采集系统，描记正常麻醉状态下的Ⅱ导联心电图。选择大鼠下腹部右或左侧部位注射10%KCl生理盐水溶液，首次选择按4 mL·kg-1BW的剂量注射，观察心电图波形15 min。以大鼠出现明显的高钾血症异常心电图波形视为模型复制成功。

2.2大鼠胸主动脉环的制备与稳定 大鼠颈椎脱臼致死，迅速开胸，游离主动脉胸腹段，置于通以95% O2+5% CO2混合气体的4 ℃K-H液的平皿中，清除血污，仔细剔除周围结缔组织，剪成约3-4 mm长的动脉环，避免过度牵拉，以防损伤血管。去除血管内皮时，用棉签磨擦主动脉环内表面以去除内皮细胞。根据实验需要，将动脉环悬挂于含K-H液的浴槽内，血管两端分别连于张力传感器和浴槽底部的不锈钢丝，使用Medlab/8C生物信号采集系统记录血管张力。动脉环先以0 g张力起步，稳定30 min，逐步调节至最适张力1.5 g，平衡1 h后开始实验，期间每15 min换液1次，浴槽内持续通以95% O2+5% CO2混合气体并保持恒温37℃。动脉环稳定后，用60 mmol·L-1KCl刺激达峰值，然后用K-H液洗脱至基线，重复3次，以激发主动脉环最大收缩幅度。待动脉环重新稳定后，浴槽中加入10-6mol·L-1PE，收缩达峰值稳定后，加入10-5mol·L-1ACh，检验血管内皮完整性。若加ACh后使PE预收缩的血管舒张60%-90%则可认为内皮完整；反之，则认为内皮被破坏[7]。

以10-6mol·L-1PE或60 mmol·L-1KCl诱发的最大收缩幅度为100%，以加入药物后的血管张力幅度与PE或KCl诱发的最大收缩幅度之间的比例反映血管张力的变化[6]。

2.3离体实验分组及处理 实验分为4组，每组8只大鼠。 (1)PE和KCl对主动脉环张力的影响组：分别观察间隔5 min累积浓度为10-8-10-5mol·L-1PE和12-60 mmol·L-1KCl对高钾血症大鼠主动脉环张力的影响，记录张力变化；以正常大鼠胸主动脉环作为对照组。(2)GD对高钾血症大鼠主动脉环基础张力的影响组：采用累积加药法，使浴槽中的GD终浓度分别达4、8、16 mg/L，记录张力变化；对照组以K-H液等容加入。(3)不同浓度GD预孵育对主动脉环张力的影响组：分别用不同浓度GD(4、8、16 mg/L)预孵育高钾血症大鼠离体胸主动脉环20 min后，观察间隔5 min累积给予10-8-10-5mol·L-1PE和12-60 mmol·L-1KCl对主动脉环张力的影响，记录张力变化；对照组以K-H液等容加入预孵育。(4)不同抑制剂预处理后GD对主动脉环张力的影响组：先用一氧化氮合酶抑制剂L-NAME(10-4mol·L-1)或鸟苷酸环化酶抑制剂MB(10-5mol·L-1)孵育高钾血症大鼠离体内皮完整胸主动脉环20 min，再加入不同浓度GD共同孵育20 min后，观察其对10-8-10-5mol·L-1PE收缩的主动脉环张力的影响，记录张力变化；对照组以K-H液等容加入预孵育。

3统计学处理

结 果

1PE和KCl对主动脉环张力的影响

分别使用累积浓度为10-8-10-5mol·L-1PE和12-60 mmol·L-1KCl处理后，结果发现其对高钾血症大鼠离体胸主动脉环收缩张力明显高于正常大鼠胸主动脉环收缩张力，二者差异显著(P<0.05)，见图1。

图1PE和KCl对高钾血症大鼠离体胸主动脉环张力的影响

2GD对高钾血症大鼠离体胸主动脉环基础张力的影响

累积给予4、8、16 mg/L GD对高钾血症大鼠离体主动脉环基础张力无明显影响(P>0.05)，见图2。

图2GD对高钾血症大鼠离体胸主动脉环基础张力的影响

3不同浓度GD预孵育对主动脉环张力的影响

结果发现，不同浓度GD(4、8、16 mg/L)预孵育后的高钾血症大鼠主动脉环对KCl收缩未见明显张力变化(P>0.05)，见表1。但16 mg/L GD预孵育后对PE收缩的内皮完整主动脉环张力则明显低于对照组(P<0.05)，见图3A。而在去内皮主动脉环上则不能产生明显的舒张作用(P>0.05)，见图3B。

表1不同浓度GD预孵育后对KCl收缩主动脉环张力的影响

GroupKCl(mmol·L-1)12243660HKR10.50±2.2740.56±8.6592.05±18.00110.74±12.77HKR+4mg/LGD10.54±1.4841.24±15.9385.68±7.88114.60±13.13HKR+8mg/LGD9.64±1.0833.38±4.3984.60±6.85115.98±10.48HKR+16mg/LGD9.19±0.2237.17±6.6587.74±13.05103.64±7.38

图3不同浓度GD预孵育后对PE收缩主动脉环张力的影响

4不同抑制剂预处理后GD对主动脉环张力的作用

先用L-NAME(10-4mol·L-1)或MB(10-5mol·L-1)孵育血管环20 min，再加入不同浓度GD共同孵育20 min后，发现4 mg/L和8 mg/L GD组均对PE收缩的内皮完整主动脉环张力无明显影响，而16 mg/L GD组对PE收缩的内皮完整主动脉环的舒张作用则明显被抑制(P<0.05)，见表2。

表2L-NAME或MB预处理后对16mg/LGD舒血管效应的影响

GroupPhenylephrine(mol·L-1)10-810-710-610-5HKR12.55±3.84*44.72±4.57*110.20±1.56**150.29±9.37**HKR+16mg/LGD5.75±1.7526.48±3.4371.95±6.01101.92±10.54HKR+L-NAME+16mg/LGD28.19±1.34*47.71±1.44*109.35±1.73**145.60±9.49**HKR+MB+16mg/LGD23.45±1.49*52.24±2.14*107.77±5.39**141.12±6.94**

*P<0.05,**P<0.01vsHKR+16 mg/L GD group.

讨 论

本实验发现，高钾血症大鼠离体胸主动脉环对PE和KCl刺激收缩的张力都明显高于正常大鼠，而高钾血症临床早期主要表现为肢体麻木苍白、极度疲乏及肌肉酸痛等，推测这可能与高血钾刺激血管收缩有关。

银杏达莫注射液(杏丁注射液)为我国第4代银杏叶提取物并在此基础上加入双嘧达莫的复合制剂, 其主要有效成分为: 银杏黄酮甙(24%)、银杏苦内酯(3.1%)、白果内酯(2.9%)、双嘧达莫(10%)[3]。由于银杏达莫具有保护血管内皮、调节血管张力、降低血管阻力、改善机体代谢及末梢血液循环障碍等作用，加之随着现代中医学对其药理作用研究的深入，目前已经广泛应用于临床治疗心力衰竭、糖尿病肾病、糖尿病神经病变等疾病。而银杏达莫注射液对高钾血症血管的直接作用尚缺乏研究。本实验在观察银杏达莫注射液对高钾血症大鼠离体胸主动脉环的作用时发现，其对主动脉环的基础张力无明显影响；对PE刺激收缩的内皮完整血管环具有显著的舒张作用，而在去内皮血管环上仅表现为微弱的舒张作用。故推测银杏达莫注射液在调节高钾血症大鼠血管环张力的过程中，血管内皮可能扮演了重要角色。

进一步实验证实，运用一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制剂左旋硝基精氨酸甲酯或可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)抑制剂亚甲蓝预处理后，可阻断银杏达莫注射液的内皮依赖性舒血管作用。而依据文献报道，一氧化氮(nitric oxide ，NO)为血管内皮细胞合成的强效血管舒张因子，NO在内皮NOS的作用下由左旋精氨酸转化而来，并通过激活平滑肌细胞sGC, 增加环鸟苷酸(cyclie guanosine monophosphate，cGMP)含量而使血管平滑肌舒张；后者主要通过cGMP依赖性蛋白激酶使钙内流减少，增加钙ATP酶对钙的摄取或直接作用于收缩蛋白去磷酸化而使血管舒张[8]，因此推测NO-sGC-cGMP途径可能介导了银杏达莫注射液的内皮依赖性舒血管作用。

此外实验还发现，银杏达莫注射液对KCl收缩的内皮完整高钾血症大鼠血管环无明显影响。既往研究认为，虽然PE和KCl都可引起血管收缩，但PE诱导的血管收缩是由α1-肾上腺素能受体的激活引起的，主要是通过三磷酸肌醇(1, 4, 5-triphosphate inositol)刺激平滑肌细胞内贮钙的释放[9]。KCl则通过平滑肌细胞超极化而刺激血管收缩，其机制主要是使钙离子通道开放，细胞外钙离子内流，从而增加细胞内钙离子的浓度[10]。因此，银杏达莫注射液舒张血管环还可能与其直接抑制血管平滑肌细胞内质网储存钙的释放有关，但这还需进一步研究证实。

综上所述，银杏达莫注射液对高钾血症大鼠血管具有内皮依赖性舒张作用，其机制可能与激活血管内皮NO-sGC途径有关，而其确切机制尚有待进一步深入研究。

[1] 林绍贤，陈桂林，黄国安，等.急慢性肾衰竭并高钾血症的防治策略[J].河北医药,2008,14(8):951-953.

[2] 程 冕，黄奕江.糖尿病病乳酸性酸中毒致高钾血症心搏骤停抢救成功1例[J].淮海医药.2010,28(2):136.

[3] 夏 霞.银杏达莫临床应用研究进展[J].实用医技杂志,2008,15(10):1344-1346.

[4] 丁卓玲，王忠全.银杏达莫临床应用研究进展[J].医药导报,2007,26(8):917- 918.

[5] 冯飞玲,卢慧玲,吴秋慧,等.EGb761对脑缺血大鼠脑组织的保护作用及机制[J].中国病理生理杂志，2009，25(6)：1217-1218.

[6] 董雅洁，卢锴峰，王经纬，等. 高钾血症实验动物模型的制备及其应用的进展[J].承德医学院学报,2009,26(3):300-303.

[7] 周新妹，杨 军，夏 强，等.芦丁对离体大鼠主动脉环的舒张作用及相关机制[J].中国药学杂志,2006,41(6):431-434.

[8] 林杨闯，胡申江，郑高暑，等.苦碟子水提取液对大鼠离体胸主动脉环的舒张作用[J].中国药理学与毒理学杂志,2007,21(3):202-206.

[9] Kobayashi S, GongMC, Somlyo AV, et al. Ca2+channel blocers distinguish between G protein-coupled pharmacomechanical Ca2+release and Ca2+sensitization[J].Am J Physiol, 1991,260(2 Pt 1):C364- C370.

[10]Leblanc N,Wan X,Leung PM. Physiological role of Ca2+-activated and voltage-dependent K+currents in rabbit coronary myocytes[J].Am J Physiol,1994,266(6Pt1):C1523-C1537.

EffectsofGinkgoleafextractanddipyridamoleinjectionontensionofthoracicaortaringsofratswithhyperkalemia

BAO Peng-ju1, 2, QI Ren-bing3, WANG Hai-hua1, 2, ZHANG Gen-bao2, HU Qian-guo1, 2, SUN Yao2

(1DepartmentofPhysiology;2InstituteofSnakeVenom,WannanMedicalUniversity,Wuhu241002,China;3DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510532,China.E-mail:wanghaihua9972@sina.com)

AIM: To investigate the effects ofGinkgoleaf extract and dipyridamole injection (GD) on the tension of thoracic aorta rings isolated from hyperkalemia rats(HKR).METHODSAfter the model of HKR was established and the preparation of the thoracic aorta rings was made, the tension of the rings was measured by a biological signal analytical system. The thoracic aorta rings were exposed to the medium containing GD at different concentrations and the vaso-constrictive tension was observed after stimulated with phenylephrine (PE) or KCl.RESULTSStimulated with PE or KCl, the tension of the thoracic aorta rings in HKR group was significantly higher than that in normal group (P<0.05). GD at the concentrations used in the experiment did not affect the basal tension in the resting rings prepared from both HKR and normal rats. In HKR group, pretreatment of the endothelium-intact thoracic aorta rings with GD at different concentrations showed no significant effect on KCl-induced vessel constriction (P>0.05). However, GD at the concentration of 16 mg/L significantly attenuated the vessel constriction induced by PE (P<0.05), which was inhibited by the pretreatment with Nω-nitro-L-arginine methylester or methylene blue. GD at different concentrations did not show significantly inhibitory effect on PE-induced tension of endothelium-denuded thoracic aorta rings in HKR group (P>0.05).CONCLUSIONGD causes endothelium-dependent relaxation in the thoracic aorta rings of HKR. This effect may be mediated by the nitricoxide-guanylyl cyclase pathway.

Ginkgobilobaextract; Dipyridamole; Hyperkalemia; Aorta

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.01.010

1000-4718(2011)01-0052-04

2010-06-11

2010-11-27

暨南大学国家中医药管理局病理生理实验室开放基金资助项目(No.2009ZD002)；安徽省高等学校自然科学研究基金项目(KJ2007B022)

△通讯作者 Tel:0553-3866058; E-mail：wanghaihua9972@sina.com