新型N-(2′-芳胺嘧啶-4′-基)-N，2，3-三甲基-2H-吲唑-6-胺衍生物的合成及其抗肿瘤活性

龙 丽， 刘冰妮， 刘 默， 储德清， 祁浩飞， 王景阳， 刘登科

(1. 天津工业大学 环境与化学工程学院 中空纤维膜材料与膜工程国家重点实验室，天津 300160；2. 天津药物研究院 天津市新药设计与发现重点实验室，天津 300193)

吲唑衍生物由于其广泛的药理活性,在抗抑郁、抗肿瘤、抗炎、抗菌、镇痛等药物[1]方面均有非常广泛的应用价值。英国Glaxo Smith Kline公司研发的第二代多靶点酪氨酸激酶抑制剂帕唑帕尼盐酸盐(Ⅰ)，化学名为5-【{4-[(2,3-二甲基-2H-吲唑-6-基)(甲基)氨基]嘧啶-2-基}氨基】-2-甲基苯磺酰胺盐酸盐，于2009年10月获FDA批准并在美国上市，临床用于治疗晚期或转移性肾癌[2,3]。 Ⅰ通过选择性抑制肿瘤细胞的VEGFR， PDGF和c-kit酪氨酸激酶起作用，效果显著[4]。

CompabcdefAr O2SH2NOH- F- FOH- MeO- Cl- F3CO-CompghijkAr CO2Me- F- MeO2C- N- - N

Scheme1

本文以3-甲基-6-硝基-1H-吲唑(1)为原料，经N-甲基化、催化还原、亲核取代及烷基化反应制得关键中间体N-(2′-氯嘧啶-4′-基)-N，2，3-三甲基-2H-吲唑-6-胺(5)； 5与芳胺(6a～6k)经亲核取代反应合成了一系列新型的N-(2′-芳胺嘧啶-4′-基)-N，2，3-三甲基-2H-吲唑-6-胺衍生物(7a～7k， Scheme 1),其结构经1H NMR和EI-MS表征。用均相时间分辨荧光法(HTRF)测定了7a～7k对酪氨酸激酶VEGFR-2磷酸化的抑制作用。结果表明，7a～7k均对VEGFR-2有一定的抑制作用，其中7a和7i具有明显的抗肿瘤活性。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

YRT-3型熔点仪；LabAlliance Series 1500型高效液相色谱仪(HPLC)；Bruker AV400型核磁共振仪(DMSO-d6为溶剂，TMS为内标)；ZAB-HS型高分辨核磁质谱仪；HTRF KinEASE-TK kit型试剂盒；SpectraMax M5型酶标仪。

2～5参考文献[5～9]方法合成。5：收率86%(83%[6])，m.p．172 ℃～173 ℃,纯度99.2%(HPLC归一化法，下同)；1H NMRδ: 2.62(s, 3H), 3.41(s, 3H), 4.05(s, 3H), 6.23(d,J=6.0 Hz, 1H), 6.87(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.49(s, 1H), 7.80(d,J=8.8 Hz, 1H), 7.93(d,J=6.4 Hz, 1H)。柱层析用硅胶，200目～300目；其余所用试剂均为分析纯。

1．2 合成

(1) 7a～7i的合成(以7a为例)

在三口瓶中依次加入5 2.86 g(100 mmol),无水乙醇50 mL和3-氨基-4-羟基苯磺酰胺(6a)1.89 g(100 mmol)，搅拌下于室温缓慢滴加浓盐酸1 mL，滴毕，回流反应3 h(TLC跟踪)。冷却至室温，过滤，滤饼干燥得白色固体7a。

用类似的方法合成白色固体7b～7i。

(2) 7j和7k的合成(以7j为例)

在三口瓶中依次加入5 3.6 g(12.6 mmol), 2-氨基-5-甲基吡啶(6j)1.62 g(15 mmol)及异丙醇30 mL，搅拌使其溶解。氮气保护下快速加入叔丁醇钾2.88 g,三(二苄亚基丙酮)二钯[Pd2(dba)3]0.36 g(3% mol,以5计算)，2-二-叔丁膦基-2,4,6-三异丙基联苯0.36 g(7% mol,以5计算),回流反应3 h。过滤，滤液蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶1]纯化得白色固体7j。

用类似的方法合成白色固体7k。

1．3 抗肿瘤活性测试

用HTRF法测定7a～7k对VEGFR-2磷酸化的抑制作用。设立3个对照试验：阳性对照(帕唑帕尼)、空白对照和Cryptate对照；酶反应体系：V(ATP) ∶V(TK Substrate-biotin) ∶V(Kinase buffer)=2 ∶2 ∶1；检测体系：V(Streptavidin-XL665) ∶V(TK Antibody-Cryptate)=1 ∶1；在314 nm激发检测665 nm和620 nm处荧光，计算其抑制率(表1)。

2 结果与讨论

2．1 合成

在2，3-二甲基-6-氨基-2H-吲唑(3)的合成中，文献[5]方法用氯化亚锡和浓盐酸还原2，3-二甲基-6-硝基-2H-吲唑(2)。该方法后处理时乳化严重，产率较低，且产生大量废水污染环境。本文改用Pd/C和甲酸铵还原体系，直接加入固体甲酸铵进行反应，而非文献[6,7]方法中加入其水溶液，有利于简化后处理操作,反应温度由25 ℃[6]提高到55 ℃，反应时间由6 h[6]缩短为1.5 h，优化了投料比，n(2) ∶n(甲酸铵)=1 ∶3，收率与文献[6]相当。

表1 7的实验结果，MS数据和抗肿瘤活性Table 1 Experimental results， MS data and antitumor activities of 7

表2 7的1H NMR数据Table 2 1H NMR data of 7

续表2

Comp1H NMR δ(J/Hz)7j2.2(s, 3H), 2.62(s, 3H), 3.46(s, 3H), 4.05(s, 3H), 5.84(d, J=6.0, 1H), 6.87(d, J=12.8, 1H), 7.44(m, 2H), 7.75(d, J=8.8, 1H), 7.86(d, J=6.0, 1H), 8.05(s, 1H), 8.12(d, J=8.4, 1H), 8.88(s, 1H)7k2.36(s, 3H), 2.62(s, 3H), 3.47(s, 3H), 4.05(s, 3H), 5.85(d, J=6.0, 1H), 6.76(d, J=7.2, 1H), 6.88(d, J=8.8, 1H ), 7.45(m, 2H), 7.75(d, J=8.8, 1H), 7.87(d, J=6.0, 1H), 8.04(d, J=8.4, 1H), 8.82(s, 1H)

在N-(2-氯嘧啶-4-基)-2，3-二甲基-2H-吲唑-6-胺(4)的合成中，文献[6]方法采用乙醇/四氢呋喃(4/1)混合溶剂反应，本文改用无水乙醇作溶剂，简化了实验操作，且收率略高于文献。

在7a～7i的合成中，反应结束后，产物直接从反应液中析出，过滤即得目标产物；而合成6j和6k时，采用上述方法则没有化合物生成，可能是吡啶环上的N原子的电负性比C原子大，使得亲核反应很难进行。本文参考Buchwald-Hartwing偶联方法[10,11]，在氮气保护下，以异丙醇为溶剂，Pd2(dba)3为催化剂，2-二-叔丁膦基-2,4,6-三异丙基联苯为配体，叔丁醇钾为缚酸剂，反应顺利进行[12]。

2．2 实验结果

7的实验结果，MS数据和抗肿瘤活性见表1；1H NMR数据见表2。从表1可见，7a和7i的抑制率分别达67．6%和71．4%，显示了较好的抗肿瘤活性。

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