表达红色荧光蛋白重组柯萨奇病毒B组3型基因组稳定性分析

赵文然，钟学宽，张淑娟，沃晓嫚，张中海，王博，钟照华

1. 哈尔滨医科大学细胞生物学教研室，哈尔滨 150086； 2. 哈尔滨医科大学地方病防治研究中心，哈尔滨 150086； 3. 哈尔滨医科大学微生物学教研室，哈尔滨 150086

柯萨奇病毒B组(coxsackie virus B，CVB)是引起病毒性心肌炎的主要病原体，在一部分患者CVB感染可发展为扩张型心肌病[1-3]。在研究CVB感染时，通常要对细胞或实验动物的病毒感染情况进行定性或定量分析，或需要明确病毒在体内复制的部位及强度。对病毒感染的定性分析方法通常为观察细胞病变(cytopathic effect, CPE)，而定量分析常用方法包括测定半数组织培养感染量(50% tissue culture infective dose, TCID50)、噬斑形成单位(plaque forming unit, PFU)，或通过反转录-聚合酶链反应(reverse transcriptase-polymerase chain reaction, RT-PCR)测定感染细胞内的病毒核酸含量[4-7]。以上几种方法虽然很可靠，但除了对病毒感染细胞进行形态观察以外，其他方法均很耗时，且操作复杂。近年来，广泛应用的生物标记技术既可对病毒感染进行定性、定量分析，又可对病毒在体内感染过程进行示踪[8-11]。荧光报告基因标记是目前常用的生物标记方法之一，其中编码红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的报告基因mCherry可用于研究多种病原体感染。mCherry的波长相对较长，可避免体内自发绿荧光的干扰[10,11]。对RNA病毒而言，由于RNA聚合酶缺乏纠错功能，病毒在复制过程中易产生基因突变[12-14]。这一特点可能影响重组RNA病毒基因组的稳定性[15]。因此，如果要通过红色荧光蛋白的表达对柯萨奇病毒B组3型(coxsackie virus B3，CVB3)的复制进行定性和定量分析，则有必要了解含mCherry报告基因的重组CVB3基因组的稳定性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 质粒、细胞及主要试剂 pMKS1由J. Lindsay Whitton教授(The Scripps Research Institute，California)惠赠。质粒peGFP-N1购自Clontech公司。重组质粒pCVB3-mCherry(图1)携带嗜心肌的CVB3 H3毒株基因组全长cDNA及红色荧光蛋白mCherry基因编码序列由哈尔滨医科大学微生物学教研室构建。该重组质粒的构建方法见文献[14]，即以pMKS1为基础，将序列两端含内切酶SfiI识别序列的mCherry基因插入CVB3基因组5′端。mCherry的激发波长为580 nm，发射波长为610 nm。HeLa细胞由哈尔滨医科大学微生物学教研室保存。质粒小量提取试剂盒、DNA小量胶回收试剂盒购自Axygen公司。DL2000 DNA Ladder、DL15000 DNA Ladder、pMD19-T Simple Vector、LATaq聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司。真核转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。胎牛血清(fetal calf serum，FCS)购自以色列Biological Industries公司(Cat: 04-001-1A；Lot: 215356)。中性红细胞染色液购自Sigma公司。细胞核染料Hoechst 33342购自Invitrogen公司，激发波长为350 nm，发射波长为480 nm。

图1 CVB3-mCherry的结构Fig.1 The structure of CVB3-mCherry

1.1.2 主要仪器 主要仪器包括Mastercycler gradient PCR仪(Eppendorf)和Axiovert 200相差倒置荧光显微镜(Carl Zeiss)。

1.1.3 主要软件及网站 Gene runner用于引物设计及多重序列比对；数据库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST用于基因组结构查询及序列比对。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒pCVB3-mCherry的扩增与纯化 取保存于-80 ℃含重组质粒pCVB3-mCherry的菌液适量，接种于5 ml含氨苄西林的LB培养基中，于37 ℃摇床振摇12～16 h(180 r/min)，可见液体浑浊。取1.5 ml菌液加入离心管中，122 000g离心1 min，弃上清液。用质粒小量提取试剂盒提取质粒，检测浓度及纯度，-20 ℃保存备用。

1.2.2 pCVB3-mCherry在HeLa细胞中的瞬时表达 于24孔细胞培养板中培养HeLa细胞，24 h后选取生长状态良好且生长至70%～90%单层细胞，用OPTI-MEMI培养基稀释脂质体和质粒pCVB3-mCherry。转染细胞时，脂质体与质粒的比为2 μl∶0.8 μg；转染时设阳性对照(peGFP-N1转染细胞)、阴性对照及未经任何处理的HeLa细胞对照；置培养板于37 ℃、 5% CO2培养箱中培养，24 h后观察荧光表达及细胞病变情况。

1.2.3 病毒的收获及传代 用pCVB3-mCherry转染HeLa细胞，当70%～90%细胞出现病变时，收获细胞，反复冻融3次，于2 000g、4 ℃离心10 min，收集上清液，称为第1代病毒，储存于-80 ℃。用第1代病毒感染HeLa细胞，待70%～90%细胞出现病变时，收获细胞，反复冻融3次，离心后收集上清液，称为第2代病毒。以此类推，将病毒连续传至第6代。

1.2.4 噬斑形成实验及病毒毒力测定 将HeLa细胞以2.5×105个/孔接种于6孔细胞培养板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养18～24 h。当细胞长至单层无缝隙时，用DMEM倍比稀释 (10倍稀释) 的病毒接种。每孔加入病毒稀释液650 μl，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养1 h，弃病毒稀释液；每孔加入2 ml固体培养基(含5% FCS的2×DMEM和1.6% 琼脂糖，1∶1配制)，放入湿盒，置37 ℃、5% CO2培养箱，30 min后倒置培养72 h。镜下观察荧光表达及CPE，根据CPE情况进行染色。于细胞培养板中加入0.05%中性红染色液，室温作用1 h，弃染液。挑选培养板中噬斑未融合且噬斑个数适中的培养孔，镜下计数噬斑个数，按以下公式计算病毒毒力：PFU/ml=每个稀释浓度噬斑的平均值/(病毒的稀释浓度×每孔病毒接种量)。

1.2.5 重组毒株的纯化及稳定性评价 取第1代病毒用于噬斑形成实验。挑取单个噬斑，接种于HeLa细胞进行扩增(100 ml规格培养瓶)，于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养；当90%细胞出现CPE时，将细胞反复冻融3次，收获病毒，此为纯化后的CVB3-mCherry第1代病毒。以同样方法纯化第2～6代病毒。分别提取每代病毒总RNA，用RT-PCR扩增重组毒株中的mCherry报告基因及CVB3基因组部分序列，经0.7%琼脂糖电泳观察扩增产物片段大小。

HeLa cells transfected with pCVB3-mCherry in light microscopy (A) and fluorescence microscopy (B). Scale bar, 100 μm.

NC：HeLa cells without CVB3-mCherry infection； CVB3-mCherry: HeLa cells infected with the first passage of CVB3-mCherry.

A: RT-PCR strategy to analyze the stability of CVB3-mCherry. B: RT-PCR results. C : Cytopathic effect of CVB3-mCherry in HeLa cells in light and fluorescence microscopy. Panel 0 represents HeLa cells without virus infection. Panel 2-6 represent HeLa cells infected with the 2-6 passages of CVB3-mCherry.

PCR引物序列如下：上游引物(P1)5′-GGCGGCAGTGTGTCGTAACGGGC- AAC-3′(CVB3的5′ UTR区)，下游引物(P2)5′-GCGTGGTTCTGTGAACTTGCCCGGG-3′(CVB3的VP4区)。如果重组病毒基因组携带mCherry基因，扩增片段预期为1 160 bp；如果重组病毒基因组丢失报告基因mCherry，扩增片段应为455 bp。用pCVB3-mCherry、pMKS-1作为扩增模板的阳性对照，ddH2O为阴性对照。将扩增产物各片段用凝胶回收法纯化，进行TA克隆，测序(北京英骏公司)后分析目的片段丢失规律。测序引物为PMD19T载体通用引物，引物序列为M13F-47(CGCCAGG-GTTTTCCCAGTCACGAC)和M13R-48(AGCG-GATAACAATTTCACACAGGA)。

2 结果

2.1 pCVB3-mCherry在HeLa细胞中的瞬时表达

用pCVB3-mCherry转染HeLa细胞，培养60 h 后，光学显微镜下可见CPE，荧光显微镜下可见细胞内红色荧光(图2)，表明CVB3-mCherry可感染细胞并在细胞内复制，可用于CVB感染的体外研究。

2.2 CVB3-mCherry的毒力

用重组质粒pCVB3-mCherry转染HeLa细胞，转染60 h后检测到红色荧光，收获第1代重组病毒，用噬斑形成实验测得病毒毒力为9.3×106PFU/ml(图3)。

2.3 CVB3-mCherry的稳定性

提取各代CVB3-mCherry基因组RNA，用于RT-PCR扩增。结果(图4B)显示，第2代和第3代重组病毒的扩增产物于1 160 bp处有较亮的条带，455 bp处未见到条带，但可见长度<455 bp的片段。随着传代次数递增，扩增产物中的1 160 bp片段显示的条带逐渐模糊；同时，长度<455 bp的未知片段则随病毒传代次数的增加而变得清晰。此结果表明，报告基因mCherry的丢失开始于重组病毒的第2代；在mCherry基因片段丢失的同时，部分CVB3基因片段也随之丢失。然而，第2～6代重组病毒所致的CPE没有显著区别(图4C)。

将RT-PCR扩增产物中3个长度<455 bp的小片段回收纯化，经TA克隆后测序，与重组质粒pCVB3-mCherry进行序列比对。其中RT-PCR获得的3个小片段长度分别为435 bp、326 bp和256 bp。435 bp片段的产生是由于重组病毒丢失了包括插入的SfiI酶切位点及mCherry全序列，并因此导致病毒开放读码框架(open reading frame，ORF)移位，但无病毒基因序列丢失；326 bp片段的产生是由于丢失了mCherry及病毒的VP4区部分序列；而256 bp片段的产生则是mCherry和CVB3 ORF全部丢失的结果(表1、图5)。

3 讨论

CVB为单股正链RNA病毒，能引起人类多种疾病，可侵犯心脏、脊髓、胰腺、肾脏、脑等多个重要器官，是病毒性心肌炎的主要病原体[1-3]。目前，对CVB感染进行定性和定量的诊断方法仍以形态学观察、测定PFU及RT-PCR为主。近年来荧光报告基因标记也广泛用于病毒检测。该方法更便捷，可用于病毒感染的定量分析及动态观察，但目前对于携带荧光报告基因的重组CVB基因组的稳定性仍缺乏了解。

本研究结果表明，重组体CVB3-mCherry能在HeLa细胞内复制并产生明显的CPE，可通过观察红色荧光蛋白表达情况来评价CVB的感染情况。此方法快速、简便。与其他普通的红色荧光蛋白相比，mCherry的优点在于有较长的发射波长、单体形式、在细胞内荧光转换效率高，因而具有较高的信噪比，更易被检测到；其次，检测时无需底物，只需激发光，既方便又节约成本[10,11]。

Red thin lines represent the locations of the fragments obtained from the 2-6 passages of CVB3-mCherry.

表1 重组病毒CVB3-mCherry与其突变体基因序列分析结果比对Fig.1 Sequence alignment between the recombinant CVB3-mCherry and its mutated progenies

(续表)

(续表)

* represents the nucleotide that is retained in CVB3-mCherry; - represents the nucleotide that has been lost from CVB3-mCherry.

基因组不稳定是小RNA病毒的共同特征[12-14]。有研究报道，与报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)重组后，CVB基因组变得不稳定，在传代过程中会丢失报告基因及部分CVB基因序列[15]。因此推测，随着传代次数的增加，CVB3-mCherry毒株的稳定性也可能有所变化。本研究表明，从第2代开始，重组病毒中就发生了报告基因丢失。丢失的序列包括插入的报告基因mCherry、CVB的5′ UTR区及部分VP4区。而第4～6代的重组病毒更不稳定，其中未发生基因片段丢失的病毒数量逐渐减少，表现为PCR产物中1 160 bp处的条带越来越模糊，而发生基因丢失的病毒数量逐渐增加。序列分析表明，由于核酸序列丢失导致病毒ORF移位，因此会产生致死性突变株，使病毒失去原有的感染性。

本研究结果表明，与含报告基因eGFP的重组CVB3类似[15]，重组CVB3-mCherry基因组也具有不稳定的特点。虽然从第2～6代重组病毒所致的CPE看不出显著变化，但包括CVB3自身基因片段在内的基因序列丢失从第2代就已存在。因此，应用时病毒传代次数不宜超过2代；长期应用则需重新用重组质粒转染敏感细胞以收获病毒。此外，应通过噬斑形成实验纯化CVB3-mCherry毒株并测定其毒力。尽管如此，该重组体仍不失为研究CVB的方便且可靠的工具。

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