BDSF对白假丝酵母体外作用的研究

周阿峰，汪联辉，翁丽星

1. 复旦大学生命科学学院微生物学和微生物工程系，上海 200433；2. 南京邮电大学信息材料与纳米技术研究院，南京 210046

假丝酵母是一类重要的人类致病菌。在美国，假丝酵母病在医院感染的大病中占第3或第4位，排名高于很多细菌感染[1,2]。更严重的是，假丝酵母病患者的病死率逐年增加，有报道称已达40%～60%[3,4]。从无害的共生菌转变为致病菌，这与宿主的免疫状态密切相关。在过去的10年内，随着免疫衰减人群(包括艾滋病患者、乙型肝炎患者、器官移植受者、肿瘤化疗患者)大幅增加，假丝酵母病激增。实际上，在儿童和成人乙型肝炎、艾滋病患者中，假丝酵母病是最常见的真菌感染[5]。假丝酵母也是感染器官移植受者的主要真菌，其中假丝酵母病导致的病死率高达50%[6]。

在假丝酵母众多致病因素中，酵母形态转变为菌丝形态是相当重要的因素之一。白假丝酵母是双相型单细胞致病菌，卵圆形的酵母相是非致病型，而菌丝相是致病型[7]。

目前，国内外学者的研究集中在不同物质对白假丝酵母形态转变的影响，且主要以酵母相为起点，鲜见以菌丝相为起点。其中，对法尼醇的研究最普遍。法尼醇由白假丝酵母分泌，是白假丝酵母群体感应分子，在白假丝酵母形态转变过程中起重要作用，达一定浓度时可阻碍其从酵母相向菌丝相转变。法尼醇的化学结构见图1。汪联辉等于2008年就可扩散信号因子(diffusible signal factor，DSF)对以酵母相为起点的白假丝酵母菌丝生长的影响进行了研究[8]。

图1 法尼醇和BDSF的结构
Fig.1 Structures of farnesol and BDSF

BDSF由Burkholderiacenocepacia分泌产生，是小分子短链脂肪酸。BDSF属DSF家族，在结构上与DSF十分相似。DSF是黄单胞菌(Xanthomonascampestris)的群体感应分子[9,10]。BDSF的化学结构见图1。近几年，Ryan等研究发现，BDSF可影响Burkholderiacenocepacia的毒力[11,12]。

白假丝酵母形态转变的调控网络极其复杂，其中已阐明位于白假丝酵母形态学调控中心位置的是Ras1p相关调控网络[11]。Ras1p是一种小GTP酶，启动2条通路：促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路和cAMP依赖的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)通路[13]。MAPK通路是一系列的磷酸化级联反应：从MAPK激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)至MAPK导致一系列转录因子激活。MAPK有5种：Cek1p、Hog1p、Mkc1p、Cek2p和Csk1p。在cAMP依赖的PKA通路中，首先腺苷酸环化酶Cyr1p催化ATP产生第二信使cAMP，cAMP水平升高激活PKA，经过一系列反应后激活转录因子Efg1p。该转录因子负责调控大多数参与形态转变的基因[13]。

本研究分别以酵母相和菌丝相为起点，初步探讨BDSF对白假丝酵母两相形态的影响，为进一步探索BDSF的功能奠定基础，尤以菌丝相为起点的研究具有开拓性意义。

1 材料和方法

1.1 菌株、培养基和BDSF的配制

菌株SC5314是白假丝酵母标准株，由中国科学院上海生命科学院陈江野老师惠赠。菌株保存于含40%甘油溶液的SDA液态培养基中，混匀后于-80 ℃冷冻保藏。保藏的菌株在固体SDA平板中复苏后4 ℃保存，每月传代1次。

复苏后的菌株于GS培养基中23 ℃摇瓶培养48 h，95%白假丝酵母保持酵母形态[12]。将培养液4 ℃保存以备实验使用。将备用酵母相移至新鲜GS培养基中，37 ℃静置培养3 h后，95%转变为菌丝相[12]。GS培养基的组成(/L)：葡萄糖5 g、Na2HPO4·12H2O 0.26 g、KH2PO40.66 g、MgSO4·7H2O 0.88 g、NH4Cl 0.33 g、生物素16 μg、1%(V/V)新生牛血清(3 kD无菌滤管过滤处理)。调整pH值为7.0[13]，过滤除菌后于4 ℃保存。

BDSF由复旦大学先进材料实验室化学合成。准确称取适量BDSF，将其溶于适量甲醇作为母液，4 ℃保存。用甲醇倍比稀释达实验所需浓度。法尼醇购自Sigma公司，配制方法同BDSF。

1.2 方法

1.2.1 BDSF对白假丝酵母酵母相的最低抑制浓度 实验分为空白对照组、法尼醇组和BDSF组。空白对照组含GS培养基、白假丝酵母和溶剂甲醇；法尼醇组含GS培养基、白假丝酵母和法尼醇；BDSF组含GS培养基、白假丝酵母和BDSF。调整白假丝酵母终浓度为1×105～5×105cfu/ml，BDSF终浓度为240、120、60、45、30、20、15、7.5、3.75和1.9 μmol/L。BDSF组和法尼醇组每个浓度设3个对照，以200个细胞为计数单位，37 ℃静置培养4 h，在倒置显微镜下计数酵母相或菌丝相的数量。采用SPSS软件计算50%最低抑制浓度(50% minimum inhibitory concentration，MIC50)和MIC90。

1.2.2 BDSF对白假丝酵母酵母相的作用 实验分为空白对照组和BDSF组。空白对照组含GS培养基、白假丝酵母；BDSF组含GS培养基、白假丝酵母和BDSF。调整白假丝酵母终浓度为1×105～5×105cfu/ml，BDSF终浓度为120、60、30 μmol/L。37 ℃静置培养。从第4小时开始，每隔2 h拍照1次。

1.2.3 BDSF对白假丝酵母菌丝相的作用 实验分为空白对照组和BDSF组。空白对照组含GS培养基、白假丝酵母；BDSF组含GS培养基、白假丝酵母和BDSF。调整白假丝酵母终浓度为1×104～5×105cfu/ml，BDSF终浓度为120、60、30 μmol/L。37 ℃静置培养。BDSF组于4 h后再加入BDSF，并以此为0点，每隔3 h拍照1次。

2 结果

2.1 BDSF对白假丝酵母的MIC

以法尼醇为阳性对照，比较BDSF和法尼醇对白假丝酵母的MIC。以浓度为横坐标、酵母相向菌丝相转化的抑制率为纵坐标作图 (图2)。采用SPSS和Excel软件处理数据，求出BDSF对白假丝酵母的MIC50为(20.7±1.6) μmol/L，MIC90为(55.1±2.8) μmol/L；而法尼醇对白假丝酵母的MIC50为(38.8±2.4) μmol/L，MIC90为(105.4±6.2) μmol/L。结果表明，对白假丝酵母菌丝生长的抑制作用BDSF比法尼醇更有效，两者差异较显著。

2.2 BDSF对白假丝酵母从酵母相转为菌丝相的抑制作用

2.2.1 30 μmol/L BDSF对白假丝酵母菌丝生长的抑制 为了解4 h后白假丝酵母的生长情况及是否有新菌丝生长，在培养4 h后，每隔2 h对白假丝酵母观察并拍照，记录其生长情况；并以200个细胞为计数单位，对其中的菌丝计数，至10 h止。以时间为横坐标、以酵母相向菌丝相转化率为纵坐标作图(图3)。结果表明，BDSF在30 μmol/L时可有效抑制90%以上酵母相向菌丝相的转化。

The dosage effects of BDSF and farnesol on morphology of C. albicans were determined microscopically on about 200 yeast cells in each treatment. The means and standard errors from three repeats are presented.

图3 以酵母相为起点BDSF对白假丝酵母菌丝生长的影响Fig.3 Effect of BDSF on hyphae growth of C. albicans from yeast form

2.2.2 30、60和120 μmol/L BDSF对白假丝酵母菌丝生长的抑制 BDSF在30 μmol/L时可有效抑制白假丝酵母菌丝生长，但随时间延长并不能抑制白假丝酵母出芽生殖。为了解增加BDSF浓度和延长培养时间对白假丝酵母菌丝生长及出芽生殖的影响，设置空白对照组和30、60和120 μmol/L BDSF组，并于4、6、8和10 h置倒置显微镜下拍照(图4)。结果表明，BDSF在30、60 μmol/L时只能抑制白假丝酵母菌丝生长；当浓度增至120 μmol/L时，白假丝酵母的菌丝生长和出芽生殖均被有效抑制。原因可能是菌丝生长和出芽生殖采取不同的代谢通路，BDSF在30、60 μmol/L时只能影响菌丝生长代谢通路，而120 μmol/L时菌丝生长和出芽生殖代谢通路均受影响。

图4 BDSF对酵母相白假丝酵母形态转变的剂量和时间效应
Fig.4 Dosage and time effects of BDSF on morphology of yeastC.albicans

2.3 BDSF对白假丝酵母从菌丝相转为酵母相的促进作用

白假丝酵母在酵母相和菌丝相之间可逆转变。一般认为，酵母相为非致病形态，而菌丝相为致病形态。白假丝酵母从酵母相转为菌丝相，毒性增加[7]。BDSF对已形成菌丝相的白假丝酵母影响见图5。空白组中，24 h内随时间增加，白假丝酵母菌丝生长旺盛，新生菌丝不断延长。BDSF在 30、60 μmol/L时可促使新生菌丝不断转变为酵母相；在120 μmol/L时，白假丝酵母的菌丝生长受强烈抑制，菌丝保持最初形态，无新生菌丝。

3 讨论

以酵母相为起点，当BDSF≥30 μmol/L时菌丝生长受强烈抑制。以菌丝相为起点，在30和60 μmol/L时，BDSF并不抑制菌丝进一步生长和产生分支，但随菌丝分支生长，新生的分支菌丝不断转变为酵母相；当BDSF增至120 μmol/L时，菌丝生长和分支状况几乎完全受抑制。

以酵母相为起点，用不同物质影响白假丝酵母菌丝生长的研究较为普遍。2001年Oh等发现法尼酸可抑制酵母相白假丝酵母的菌丝生长[12]，并将其视作调节白假丝酵母形态转变的自诱导物质；但后来证实为法尼醇。2008年汪联辉等发现DSF可抑制酵母相白假丝酵母的菌丝生长[8]。以菌丝相为起点，用不同物质影响白假丝酵母菌丝生长的研究较罕见。2001年Oh等曾发表观点：法尼酸可逆转白假丝酵母从菌丝相转为酵母相[14]，但至今并无充分证据。本文研究结果表明，BDSF对白假丝酵母从酵母相转为菌丝相起抑制作用，对从菌丝相转为酵母相起促进作用。

位于白假丝酵母形态学调控中心的是Ras1p相关调控网络，其中研究较细致的是MAPK通路和cAMP依赖的PKA通路。2004年Sato等证实，法尼醇经MAPK通路抑制白假丝酵母菌丝生长[15]。至于BDSF是否经其中1个或2个通路，抑或其他通路对白假丝酵母菌丝生长产生抑制作用，有待进一步实验证实。

白假丝酵母致病时多在病灶部位形成生物膜。该生物膜是由酵母相、假菌丝和真菌丝3种形态相互交织形成的致密结构。BDSF在实验室条件下可有效抑制菌丝生长并促使菌丝相转化为酵母相，为防治白假丝酵母病提供了崭新思路。但临床上能否攻克生物膜这个堡垒，尚需进一步研究。

图5 BDSF对菌丝相白假丝酵母形态转变的剂量和时间效应
Fig.5 Dosage and time effects of BDSF on morphology of hyphaeC.albicans

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