HPLC法测定抗骨增生片中柚皮苷含量

张智军 崔 华 马久太

(1彬县食品药品监督管理局，陕西省彬县西大街老政府院内，713500;2陕西摩美得制药有限公司;3陕西步长制药有限公司)

抗骨增生片由熟地黄、鹿衔草、骨碎补、鸡血藤、淫羊藿、肉苁蓉、莱菔子等七味中药组成，具有补肾、活血、止痛的功能，主治肥大性脊椎炎、颈椎病、跟骨刺、增生性关节炎、大骨节病，效果良好［1］。为了更好地控制产品质量，我们在其原质量标准的基础上，对骨碎补中的有效成分柚皮苷进行了含量测定，并对方法学进行了研究，报道如下。

1 仪器与试剂

高效液相色谱仪(岛津LC-20AD);色谱工作站(岛津LC-solution);紫外检测器(岛津SPD-M20A);电子天平(梅特勒-奥豪斯AR1140);超声波清洗器(昆山KQ-250V)。

柚皮苷对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号110722-200809，供含量测定用);抗骨增生片(陕西摩美得制药有限公司生产，批号050615、050616、050617);乙腈为色谱纯;用水为重蒸水;其他试剂为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;检测波长283nm;乙腈-水-冰醋酸(14∶86∶4)为流动相;流速 1.0mL·min-1;柱温40℃;理论塔板数以柚皮苷计算应不低于2000。在此色谱条件下供试品分离度高，阴性无干扰。

2.2 供试品溶液的制备 取本品10片，研细，取0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，回流提取60min，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 线性关系考察 精密称取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1mL含7.1μg的溶液，摇匀，作为对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液 4、6、8、10、12、14μL，分别注入液相色谱仪，记录峰面积，结果见表1。以C代表进样量、A代表峰面积，计算回归方程为 A=3325664.59C-7467.15，r=0.9999;柚皮苷在 0.0284～0.0994μg之间有良好的线性关系。

表1 柚皮苷线性关系考察结果

表2 精密度试验结果

2.4 精密度试验 精密吸取柚皮苷对照品溶液(7.1μg·mL-)10μL，按照上述色谱条件，注入液相色谱仪中，连续进样6次，记录峰面积，结果见表2。结果对照品溶液峰面积RSD为1.01%，表明本方法精密度良好。

2.5 稳定性试验 取样品(批号050615)适量，制备供试品溶液，按照上述色谱条件，分别于 0、2、4、8、16h，注入液相色谱仪中，记录峰面积，结果见表3。结果表明，供试品溶液峰面积在16h内RSD为1.72%，表明本方法稳定性良好。

表3 稳定性试验结果

2.6 重现性试验 取样品(批号050615)适量，6份，制备供试品溶液，按照上述色谱条件，制备供试品溶液，按照上述色谱条件，注入液相色谱仪中，记录峰面积，结果见表4。结果表明，样品含量RSD为1.77%，表明本方法重现性良好。

表4 柚皮苷重现性试验

2.7 回收率试验 取样品(批号050615)0.2g，各6份，精密称定，同时加入样品中含量80%、100%和120%的柚皮苷对照品，制备供试品溶液，按照上述色谱条件，注入液相色谱仪中，记录峰面积，结果见表5。结果表明，平均回收率为98.76%，RSD为0.68%，表明本方法回收率良好。

表5 回收率试验结果

2.8 样品测定 按照上述方法制备供试品溶液，参照上述色谱条件操作，测定含量，结果见表6。药品的质量，受药材、设备、工艺等多种因素影响，根据3批抗骨增生片的含量测定结果，在其含量平均值0.66mg·g-1的基础上，以70%转移率计算，暂定抗骨增生片中柚皮苷含量限度为每1片不得低于0.66×0.4×70%=0.18mg，从而保证了产品的安全与有效。

表6 抗骨增生片柚皮苷含量测定结果

3 结论

1)骨碎补为抗骨增生片中的臣药，柚皮苷为其主要有效成分，具有补肝肾强筋骨的作用，可促进骨损伤骨质生长、预防激素性骨质疏松、抗炎、镇痛、降血脂作用、强心、镇静［2］。原质量标准中没有含量测定项目，为了更好地控制产品质量，我们对骨碎补中的有效成分进行了含量测定。

2)柚皮苷含量测定方法有分光光度法［3］、薄层扫描法［4］、高效液相色谱法［5］等，本产品采用高效液相色谱法对抗骨增生片中的柚皮苷进行含量测定，结果平均回收率为98.76%，RSD为0.68%，方法灵敏、准确、重现性好。

3)实验中［5-6］曾选用甲醇-醋酸-水(35:4:65)、乙腈-水-冰醋酸(20∶80∶4)、乙腈-水 -冰醋酸(14∶86∶4)为流动相，结果前2个条件未能达到满意分离效果;后者分离度好，阴性无干扰，所以实验最终选用后者为流动相。

试验研究［7-8］中曾考察了柚皮苷的不同提取方法，结果以回流提取法＞索氏提取法＞超声提取法，说明温度较高条件下柚皮苷容易提取;同时回流提取60min，能够将抗骨增生片中柚皮苷提取完全。

［1］抗骨增生片质量标准(标准编号WS3-B-1338-93).中华人民共和国卫生部部颁标准《中药成方制剂》第七册［S］.1993:74.

［2］陈顺，关延彬.骨碎补药理作用的研究进展［J］.医药导报，2006，25(7):685-687.

［3］范晓清，李雪婷，王沛.紫外分光光度法测定痛风宁微丸中柚皮苷的含量［J］.中国卫生工程学，2011，10(3):247-248.

［4］李晓光，林励，陈志霞.薄层扫描法测定化橘红中柚皮苷的含量［J］.浙江中医学院学报，2003，27(1):82.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部［S］.北京:化学工业出版社，239.

［6］郭丽红，郑国钧，苗爱东.高效液相色谱法测定解表清肺丸中柚皮苷、橙皮苷、黄芩苷的含量［J］.药物分析杂志，2009，29(9):1493-1495.

［7］于宏伟，谷维娜，李娜.柚皮苷的提取方法及其应用研究进展［J］.湖北农业科学，2011，50(8):1516-1518.

［8］陈永刚，林励，魏燕华.超声波提取法与索氏提取法提取化橘红柚皮苷的比较研究［J］.中药新药与临床药理，2008，19(4):309-311.