微波辅助萃取蚕沙叶绿素的工艺研究

邓祥元，沙 鹏，高 坤

（江苏科技大学生物与化学工程学院，江苏 镇江 212018）

蚕沙作为家蚕幼虫食桑后的排泄物，具有较高的营养和药用价值。研究表明，蚕沙中叶绿素含量约0.8%～1.0%（干物质量分数），高于其他植物中叶绿素含量[1]。从蚕沙中萃取叶绿素具有纯度高、成本低、操作方便等优点。叶绿素是脂溶性卟啉类化合物。目前，叶绿素的萃取方法主要有有机溶剂法、超临界CO2法、吸附树脂法等[2]，其中超临界CO2法能降低萃取时间，减少萃取剂使用量，但操作复杂、设备昂贵、成本较高，其应用领域受限。而有机溶剂法直接利用叶绿素易溶于有机溶剂的特点，选用合适有机溶剂萃取并辅助了微波、超声波或离子交换分离等手段来提高效率和纯度，其中微波辅助法，与传统方法相比具有穿透力强、选择性高、萃取时间短、节约能源等优点，是天然产物提取中有发展潜力的新技术。叶绿素含量的测定方法主要有分光光度法、荧光分析法、活体叶绿素仪法、光声光谱法和高效液相色谱法等[3]，其中分光光度法具有操作方便、准确度高、重复性好等优点，广泛应用叶绿素含量测定过程中。

本研究采用微波辅助法从蚕沙中萃取叶绿素，并利用分光光度法对叶绿素含量进行测定，通过比较分析微波压力、微波时间及微波功率等工艺参数对叶绿素萃取效率的影响，探索其最优萃取工艺，为蚕沙叶绿素的进一步研究提供实验数据支持，也为蚕沙叶绿素的大规模工业化开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

蚕沙由中国农业科学院蚕业研究所养蚕室提供，自然晾干后，除去桑叶渣、石灰、沙子等杂质，置于60℃烘箱中烘干，用粉碎机粉碎后，过40目标准筛，获得干蚕沙粉，避光保存备用。

1.2 仪器和试剂

高通量密闭微波消解系统（CEM-MARS型，美国培安公司产品）；紫外-可见分光光度计（UV-1800PC型，购自上海美谱达仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9101-ISA型，上海三发科学仪器有限公司产品）；手提式中药粉碎机（DFT-50型，购自山东青州三阳包装设备有限公司）；所用试剂（上海国药集团化学试剂有限公司）分析纯试剂。

1.3 方法

1.3.1 叶绿素萃取方法

准确称取0.02 g干蚕沙粉，加入0.75 mL软化剂Na2CO3（0.05 g·mL-1）以阻止叶绿素降解成脱镁叶绿素[4]，以4 mL丙酮比乙醇为2∶1的混合溶液为萃取剂（料液比为1∶200），在微波辅助下萃取叶绿素，萃取结束后，利用常温离心机以5 000 r·min-1离心5 min，取上清液于光径为1 cm的比色皿中，用紫外-可见分光光度计测定其吸光度值，并利用Arnon法的修正公式计算叶绿素a的浓度，进而比较不同工艺参数对蚕沙叶绿素萃取效率的影响。

1.3.2 单因素试验方法

以0.02 g蚕沙粉为原料，按1.3.1的方法萃取叶绿素，并以蚕沙叶绿素a的浓度为指标，考察不同微波压力、微波时间及微波功率等工艺参数对蚕沙叶绿素萃取效率的影响。

1.3.3 正交试验设计方法

正交试验设计是研究多因素多水平的一种设计方法，根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备“均匀分散，齐整可比”的特点，是一种高效、快速、经济的试验设计方法。在单因素试验的基础上，以微波压力、微波时间及微波功率等4因素设3水平（见表1），采用L9（34）的正交试验，设计9组工艺萃取条件，并以蚕沙叶绿素a的浓度为指标，探索微波辅助法萃取蚕沙叶绿素的最优工艺。

表1 蚕沙叶绿素萃取的L9（34）正交试验因素与水平设计Table 1 Factors and levels design of L9(34)orthogonal tests for chlorophyll extraction from silkworm faeces

1.3.4 叶绿素浓度的测定方法

利用紫外-可见分光光度计，在663 nm和645 nm处测量所提蚕沙叶绿素的吸光度值，然后利用Arnon法的修正公式[5-7]进行计算：

叶绿素a浓度（mg·L-1）：Ca=12.7A663-2.69A645

叶绿素a浓度（mg·g-1）：Ca'=

式中，V-萃取剂体积（mL）；n-稀释倍数；m-样品质量（g）；Ca和Ca'均为叶绿素a浓度，单位分别为 mg·L-1和 mg·g-1；A645、A663分别代表在波长为645和663 nm下的吸光度值，所有试验均重复3次。

2 结果与分析

2.1 微波压力对蚕沙叶绿素萃取效率的影响

比较微波压力分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 MPa时，不同微波压力对蚕沙叶绿素萃取效率的影响。结果见图1，结果表明，随着微波压力增大，叶绿素a浓度不断升高，当微波压力为0.4 MPa时叶绿素a浓度达到最大值，当微波压力超过0.4 MPa后，叶绿素a浓度迅速降低。这主要是由于当达到一定压力后，温度迅速升高，随着温度升高，溶剂选择性变差[9]，蚕沙中除叶绿素外的一些其它杂质被萃取出来；同时温度越高，对蚕沙叶绿素的破坏作用越大，萃取剂的挥发也越快，造成萃取率的下降。因此在实际生产中，选择0.4 MPa为微波压力，能够使萃取效率最大化。

图1 微波压力对蚕沙叶绿素萃取效率的影响Fig.1 Effect of different microwave pressures on chlorophyll extraction efficiency from silkworm faeces

2.2 微波时间对蚕沙叶绿素萃取效率的影响

设定10、20、30、40、50、60、70、80 s等8个微波时间点，比较研究不同微波萃取时间对蚕沙叶绿素萃取效率的影响结果见图2。由图2可知，萃取率随着微波时间的增加而迅速增大，50 s达到最大值，说明微波处理加速了蚕沙叶绿素的浸出，随时间的变化不显著（P＞0.05），80 s后萃取率迅速下降（P＞0.01）。由于蚕沙叶绿素在原料与萃取剂之间的浓度差，推动着蚕沙叶绿素扩散至原料固体表面并溶解进入萃取剂。在萃取初始，两相间浓度差较大，促进了蚕沙叶绿素快速溶解并扩散至萃取剂，随时间的推移，蚕沙叶绿素在溶剂中的浓度不断增大，浓度差逐渐变小，扩散速度变慢，萃取一定时间后，两相间浓度达到平衡，萃取过程基本完成，这时继续延长微波时间也并不能提高萃取率，反而会由于微波时间过长而造成蚕沙叶绿素的损失、杂质的溶出和溶剂的挥发[9]。因此选择微波时间在50 s为较优的工艺条件。

2.3 微波功率对蚕沙叶绿素萃取效率的影响

取0.02 g蚕沙粉，在微波压力为0.4 MPa的条件下，设定50、100、200和300 W的微波功率，微波处理50 s后，测定蚕沙叶绿素的吸光度值（A663和A645），并计算叶绿素a的浓度，微波功率对蚕沙叶绿素萃取效率的影响结果见图3。由图3可知，随着微波功率的增加，蚕沙叶绿素的萃取率逐渐升高，在高通量密闭微波消解系统所允许的最高功率范围内，未发现微波功率对蚕沙叶绿素萃取效率的负影响。由于随着微波功率的增大，分子震动加快，摩擦增加，有利于叶绿素等目标成分的溶出，使叶绿素浓度较高；但由于受到仪器设备限制，本研究未能探讨微波功率继续增大是否会导致叶绿素浓度的进一步提高，但从其他研究结果来看，微波功率的继续增大会使叶绿素浓度增加的速率变慢，未出现负影响[10]。因此，选择微波功率为300 W是较优工艺条件。

图2 微波时间对蚕沙叶绿素萃取效率的影响Fig.2 Effect of different microwave time on chlorophyll extraction efficiency from silkworm faeces

图3 微波功率对蚕沙叶绿素萃取效率的影响Fig.3 Effect of different microwave output powers on chlorophyll extraction efficiency from silkworm faeces

2.4 正交试验结果

在单因素试验的基础上，采用L9（34）的正交试验设计进一步考察微波压力、微波时间、微波功率3个因素对萃取效率的影响。按照1.3.3中正交试验设计进行试验，其试验结果见表2。根据表2的试验结果，从极差（R）的大小来看，影响蚕沙叶绿素萃取效率的因素大小为：微波压力＞微波功率＞微波时间，其最优水平组合为：A2B3C3，即微波压力为0.4 MPa、微波时间为60 s、微波功率为300 W。

此外，为了进一步确定各因素对蚕沙叶绿素萃取率的影响程度，对表2中的数据进行方差分析和显著性检验，结果见表3。

表2 蚕沙叶绿素萃取的正交试验结果Table 2 Results of orthogonal tests for chlorophyll extraction from silkworm faeces

表3 蚕沙叶绿素萃取的正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests for chlorophyll extraction from silkworm faeces

从表 3 方差分析可知，F0.05＜FC＜FA＜F0.01，表明微波压力和微波功率对蚕沙叶绿素萃取效率的影响是显著性因素，而微波时间则对萃取效率无显著性影响。因此，综合考虑生产成本等因素，应选择的萃取工艺条件是微波压力为0.4 MPa，微波时间为50 s，微波功率为300 W。

取3份蚕沙样品，在选择的工艺条件下进行蚕沙叶绿素萃取试验，所得叶绿素a的浓度为14.325 mg·L-1，较其它条件下的叶绿素a浓度高。从而，最终确定微波辅助萃取蚕沙叶绿素的最优工艺条件是微波压力为0.4 MPa，微波时间为50 s，微波功率为300 W。

3 讨论与结论

本研究以蚕沙为原料，采用微波辅助法萃取叶绿素，并以叶绿素a的浓度为指标，通过单因素试验和正交试验设计优化微波辅助法的工艺条件。

a.尽管叶绿素a和b在结构上有细微的差别，但在叶绿素萃取过程中，叶绿素a和叶绿素b浓度的变化趋势基本一致，这与众多研究的试验结果相同[7,11-12]，说明结构上的差异并不影响萃取过程的进行，但叶绿素a较叶绿素b的浓度高，叶绿素a/b值为3，而叶绿素a浓度容易测定、误差较小，因此采用叶绿素a的浓度为指标优化蚕沙叶绿素的微波辅助法的萃取工艺。

b.微波压力和微波功率是影响蚕沙叶绿素萃取效率的显著性因素。本研究所得最优微波压力和微波功率较其他研究低[13]。而微波时间作为影响蚕沙叶绿素萃取的非显著因素，其优化结果与前人研究结果[13]一致。

用微波辅助法萃取蚕沙叶绿素，其最优工艺条件为：微波压力为0.4 MPa，微波时间为50 s，微波功率为300 W。在此最优工艺条件下，蚕沙叶绿素a的浓度可达到14.325 mg·L-1。且与传统的叶绿素萃取工艺相比，微波辅助法具有萃取时间短，萃取温度低，工艺简单，成本低廉，产品质量高等优点，可供工业生产蚕沙叶绿素参考。

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