不同加成数C60-β-丙氨酸衍生物的还原能力及金属螯合能力

孙 涛，孙 斐，巢 骏，谢 晶，周冬香

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海海洋大学海洋科学研究院，上海 201306）

自1985年发现富勒烯（C60为其代表物质）以来[1]，关于水溶性C60衍生物抗氧化性的研究引起广泛关注[2-4]。自由基是带有未成对电子的分子或离子，生物体内自由基的产生和清除一般是平衡的，一旦失衡就会对机体造成氧化伤害，导致蛋白质变性、酶失活、脂质过氧化等[5-6]。金属离子可催化自由基的产生。自由基氧化是一种自动链式反应，脂氧化酶或是光照可诱导反应发生，诱导剂是金属离子。自由基氧化可以导致DNA断裂，若在金属离子的催化下，断裂速度将会增加数倍。金属离子同样也是自由基氧化碳水化合物过程中的催化剂。体内钠钾泵是自由基攻击目标之一，在金属离子的参与下，其损伤程度将会加剧。因此，金属离子在自由基氧化过程中发挥着重要作用。

文献已报道过C60-β-丙氨酸具有清除超氧阴离子、羟基自由基的能力[7]以及对由活性氧聚集引起的PC12细胞损伤的保护作用[8]，但是关于还原能力以及金属螯合能力的研究尚未进行。本试验合成了三种不同加成数目的水溶性C60-β-丙氨酸衍生物并对其还原能力及金属螯合能力进行考察，以期为水溶性C60衍生物在生物医学领域中应用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

C60纯度＞99.9%（河南永新试剂公司）；β-丙氨酸（上海国药试剂有限公司）；菲洛嗪（美国Fluka公司）；甲苯、乙醇、氢氧化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾、三氯化铁、氯化亚铁等均为分析纯。

Nicolet Nexus 470型红外光谱仪（美国Nicolet）；UV-1800PC型紫外分光光度计（上海Mapada）；DMX 500型核磁共振波谱仪（德国Bruker）；MOD 1106型元素分析仪（意大利Cario Erba）；UV-2000型紫外分光光度计（上海尤尼柯）；TDL80-2B型台式离心机（上海安亭）；HHS型电热恒温水浴锅（上海博迅）；79-3型恒温磁力搅拌器（上海司乐）；Delta 320型pH计（瑞士Mettler Toledo）；AB204-N型分析天平（瑞士Mettler Toledo）。

1.2 C60-β-丙氨酸衍生物的合成

按照文献[9]设计合成C60-β-丙氨酸衍生物的方法，分别取40.0 mg β-丙氨酸和2.0 g氢氧化钠溶于12 mL去离子水中，加入80.0 mL无水乙醇，搅拌下缓慢滴加C60甲苯溶液（250.0 mg/250.0 mL），室温下搅拌5 d，至有机层中紫色消失，说明C60已反应完全。分液移去无色有机层，将黑色溶液层用蒸馏水稀释，再加入无水乙醇使产物沉淀，将产物用水和无水乙醇反复沉淀，40℃经真空干燥得到黑褐色固体粉末A。茚三酮试验显示产物中不含游离β-丙氨酸。将β-丙氨酸用量分别改为200.0 mg和2.5 g，重复上述实验，分别得到黑褐色的固体粉末B和C。

1.3 C60-β-丙氨酸衍生物的表征

对产物A、B和C进行FT-IR、UV、1H MNR和元素分析（C、N、H）测试。红外光谱采用KBr压片法制样，测定波数范围为400～4 000 cm-1，分辨率为2 cm-1。紫外光谱，测定波长范围为200～800 nm，分辨率为0.5 nm。核磁共振，500 MHz，溶剂D2O。

1.4 还原能力的测定

还原能力测试根据文献[10]测定并稍做改进。取2.0 mL不同浓度样品，加入pH 6.60的0.2 mol·L-1磷酸缓冲液和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，混匀。50℃水浴20 min后迅速冷却，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀后在3 000 r·min-1下离心10 min，取上清液2.0 mL，加入2.5 mL去离子水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，静置10 min后在700 nm处测定吸光度。

1.5 金属螯合能力的测定

按文献[11]稍加修改测定反应产物的金属螯合能力。取不同浓度的样品溶液3.5 mL，加入0.1 mL 2.0 mmol·L-1的氯化亚铁溶液和0.2 mL 5.0 mmol·L-1的菲洛嗪溶液，混和均匀。混合液室温静置10 min，并于562 nm处测定其吸光度。计算其金属螯合能力：螯合能力（%）=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。式中，A0-用水代替样品所测得的吸光度；Ai-样品所测得的吸光度；Aj-样品本身的吸光度。

2 结果与分析

2.1 结构表征

C60-β-丙氨酸衍生物的红外图谱如图1所示，三种衍生物A、B、C均有在521 cm-1处的吸收峰（C60的特征吸收峰），1 066 cm-1处的吸收峰（NC60），1 400 cm-1处的吸收峰（COO-），1 560 cm-1处的吸收峰（C-N），3 414 cm-1处吸收峰（N-H），与文献[9]报道一致，表明合成出的产物是C60-β-丙氨酸衍生物。

C60、β-丙氨酸和C60-β-丙氨酸衍生物的紫外图谱（见图2），β-丙氨酸和C60-β-丙氨酸衍生物在210 nm处有吸收峰，C60在296 nm处和353 nm处有吸收峰，说明C60-β-丙氨酸衍生物保留β-丙氨酸的吸收峰，但在C60原有吸收峰处发生改变。

C60-β-丙氨酸衍生物的1H NMR图谱（D2O，500 MHz）如图3所示，在1.1、3.4 ppm处的吸收峰是C60-H的吸收峰，与文献[8]报道一致。

元素分析结果显示，C60-β-丙氨酸衍生物A、B和C中碳∶氮∶氢的比例分别为60.7∶2∶1、30.3∶2∶1、17.9∶2∶1，说明C60-β-丙氨酸衍生物A、B和C中与C60上连接的β-丙氨酸的平均数目分别是2，4，8（计算值分别为1.85，4.09，8.07）。

图1 C60-β-丙氨酸衍生物的红外图谱Fig.1 FTIR spectra of β-alanine C60derivatives

图2 C60-β-丙氨酸衍生物的紫外图谱Fig.2 UV spectrogram of β-alanine C60derivatives

图3 C60-β-丙氨酸衍生物的1H NMR图谱Fig.3 1H NMR of β-alanine C60derivatives

2.2 还原能力

C60-β-丙氨酸衍生物的还原能力如图4所示，随浓度增加，三种衍生物A、B和C的吸光值增加，还原能力增强。同时，β-丙氨酸在这个浓度范围内无还原能力。在浓度为2.5 μmol·mL-1时，三种衍生物A、B和C的吸光度分别是0.424，0.612和1.040。还原能力大小顺序为C＞B＞A，即随加成度增加，C60-β-丙氨酸衍生物的还原能力增强。

图4 C60-β-丙氨酸衍生物的还原能力曲线Fig.4 Reducing power of β-alanine C60derivatives

2.3 金属螯合能力

C60-β-丙氨酸衍生物的金属螯合能力如图5所示，随着浓度的增加，三种衍生物A、B和C的金属螯合能力逐渐增强。同时，β-丙氨酸在这个浓度范围内几乎没有金属螯合能力。当螯合率达到50%时，所需三种衍生物A、B和C的浓度分别是0.348、0.261和0.135 μmol·mL-1。它们的金属螯合能力大小顺序为C＞B＞A，即随着加成度的增加，C60-β-丙氨酸衍生物的金属螯合能力不断增强。

图5 C60-β-丙氨酸衍生物的金属螯合能力曲线Fig.5 Chelating ability of β-alanine C60derivatives

3 讨论与结论

a.C60-β-丙氨酸衍生物的还原能力主要与C60-β-丙氨酸衍生物分子上C=C双键的数量、位阻效应和加成基团的性质有关[12]。在还原能力测试中，β-丙氨酸无还原能力，而富勒烯化学研究表明，富勒烯还原金属离子主要是通过打开C=C双键来提供电子[3]，因此C60-β-丙氨酸衍生物的还原能力主要来自于C60上保留下来的双键。C60与胺类物质之间的反应倾向于1，2-加成或1，4-加成反应[13]。随着加成基团的增加，阻碍铁离子进攻C=C双键所形成的空间位阻增大，导致C60-β-丙氨酸衍生物的还原能力降低。β-丙氨酸与C60以一个-NH基相连，-NH基是一个强供电子基团，其供电效应使具有不饱和烯烃性质的C60上的C=C双键的电荷密度增大，C=C双键给出电子，还原能力增强。三种C60-β-丙氨酸衍生物还原能力的大小顺序为C＞B＞A，说明在这个体系中-NH基供电效应对C60-β-丙氨酸衍生物还原能力占主导因素。

b.一些不饱和烯烃如乙烯（CH2=CH2）、乙炔（CH≡CH）可与金属离子形成配合物。具有成键π电子和能量较高的空π*分子轨道，给出其成键π电子与金属离子形成σ配位键或者其空轨道接受金属离子的电子形成反馈π键配位键。C60具有不饱和烯烃的性质，与金属离子形成配位键[14]。随着C60-β-丙氨酸衍生物侧链β-丙氨酸以及-NH基数目的增加，分子极性增强，π键电子云密度也不断增加，使C=C双键更容易与金属离子形成配位键，因此C60-β-丙氨酸衍生物的金属螯合能力不断增强。三种C60-β-丙氨酸衍生物金属螯合能力的大小顺序为C＞B＞A，即随加成度增加，C60-β-丙氨酸衍生物的β-丙氨酸侧链数量增加，金属螯合能力增强。

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