LC-MS/MS法分析北五味子中的木脂素成分

田宏哲，徐 静，胡 睿，赵瑛博，刘文娥

1沈阳农业大学分析测试中心，沈阳 110866;2辽宁出入境检验检疫局，大连 116001

我国具有丰富的天然植物资源，其中五味子及其同科类植物在我国分布范围很广，是常用中药材。五味子科(Schisandraceae)含五味子属(Schisandra)和南五味子属(Kadsura)2个属约60种，我国含有两属的植物约30种。其中五味子属约19种，在我国大部分省区都有分布，该属最常用的药材是五味子(S.chinensis，北五味子)和华中五味子(S.sphenanthera)。五味子属植物主要含有木脂素、三萜、挥发油、多糖、有机酸、氨基酸及微量元素等化学成分。其中，木脂素为其主要活性成分，有降酶保肝、抑制中枢神经、抗衰老等作用。20世纪70年代，我国学者从五味子中分离得到五味子素等7种具有明显降谷丙转氨酶(SGPT)作用的木脂素后，中国和日本的学者［1-4］对五味子及其同科植物的木脂素成分展开了广泛的分离鉴定工作，获得了显著成果，目前五味子的开发应用也主要是集中在治疗肝炎的新药方面。

木脂素是由二分子苯丙烯衍生物聚合而成的化合物，多数为游离状态，或与糖结合成甙。五味子中含有丰富的木脂素成分，从植物中提取的木脂素类物质活性广泛，有多种生理活性。如经过进一步结构修饰和改造，可能获得更高效的药物活性成分［5，6］，这是我国天然药物开发的重要方向之一，值得进一步研究。

目前测定五味子中木脂素主要采用液相色谱-紫外法［7-10］、液相色谱-质谱法［11］、薄层色谱法［12］等，但五味子木脂素衍生物较多，立体化学复杂，采用液相色谱-紫外法很难将复杂组分完全分开，影响定量准确性。而薄层色谱法由于分离效率低，不适于复杂组分分离。

本文建立了LC-MS/MS法同时测定五味子中6种木脂素成分，采用正己烷提取待测样品中的目标组分，经反相高效液相色谱分离，待测组分先后进入DAD检测器和离子阱质谱中进行测定，该方法排除了样品基质和杂质成分的干扰，可对目标组分进行准确的定性定量。通过对五味子样品中6种木脂素成分的测定，对该方法进行评价。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100 LC-Trap SL进行五味子中木脂素的液相色谱-质谱测定，配有四元梯度泵、自动进样器、二极管阵列检测器(DAD)等。质谱直接进样注射泵(kd Scientific，USA)。KQ-300DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);RE-52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

甲醇(色谱纯，Fluka)。实验用“娃哈哈”纯净水(娃哈哈集团，杭州)，其它试剂均为分析纯。配制的流动相均经过0.45 μm微孔滤膜过滤。木脂素标准品:五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素(纯度 ＞99.0%，购自Sigma-Aldrich)。以上标准样品用色谱纯溶剂配成1000 mg/L的储备液，然后稀释到1.0 mg/L进行流动注射进样，分别获取标准样品的一级和二级质谱图，得到准分子离子峰和碎片离子峰的信息。北五味子果来源于辽宁抚顺药材种植基地。

1.2 样品制备

将五味子果实在80℃左右烘4 h，然后粉碎过100目筛。准确称取1.0 g五味子粉末，用50 mL正己烷超声提取30 min后，用正己烷补足损失量，移取20 mL提取液到离心管中，离心10 min(3500 r/min)。取5 mL上清液于鸡心瓶中，在40°C水浴蒸至近干，然后用5 mL甲醇重新溶解，过0.45 um滤膜，待分析。

1.3 液相色谱条件

SB-C18色谱柱(150 mm × 2.1 mm i.d.，3.5 μm，Agilent)，流动相为甲醇和0.5%甲酸，梯度洗脱，0～35 min甲醇由55%到95%，保持5 min，然后回到初始流动相组成，平衡7 min，流速0.2 mL/min，柱温30 ℃，进样量5 μL，检测波长260 nm。

1.4 质谱条件

ESI电离源，正离子化模式;干燥气:8.0 L/min;干燥温度:325°C;雾化气压力:30 psi;毛细管电压:4500 v。扫描范围:100～650 m/z。多反应模式监测(MRM)(液相色谱-质谱联用优化参数见表1)。

表1 采用液质联用方法分析目标五味子木脂素的优化参数Table 1 Optimised parameters for the studied lignans analysed by LC-ESI-MS/MS

2 结果与讨论

2.1 木脂素的液相色谱-质谱检测方法建立

首先考察了不同流动相对目标组分分离的影响:甲醇-醋酸铵、甲醇-甲酸铵、甲醇-甲酸水溶液等，几种流动相都能把目标组分完全分离。但在分离实际样品时，以甲醇-甲酸水溶液的分离效果最好，在液相色谱-紫外检测中谱峰尖锐，在质谱中离子化效率高(见图1)，所以选择甲醇-甲酸水溶液作为本方法的流动相。

在190～400 nm内对目标组分进行了紫外吸收波长扫描，发现在260 nm左右时，6种木脂素均有响应，且响应值较高，因此选择260 nm作为检测波长，标样谱图见图2。

实验中对质谱分析条件进行了优化:确定质谱离子化模式、干燥气压力、温度、雾化电压、传输及聚焦区参数设置等。由于在液相色谱-质谱联用分析有机化合物时，当采用电喷雾电离源(ESI)时，一级质谱全扫描模式只能提供目标组分的分子离子峰，很难排出杂质成分的干扰，会造成定性以及定量的误差。本文建立了LC-ESI-MS/MS方法分析木脂素组分，以MRM模式提供的目标组分的母离子与子离子组成的离子对进行定性和定量分析(见表1)，从而排除其它组分及未完全分离组分对目标组分的定量干扰。

2.2 提取溶剂的选择

目前，提取五味子中木脂素主要采用乙醇、甲醇、正己烷、环己烷及氯仿等有机溶剂进行超声提取、索氏提取或者微波提取等。在本实验中尝试了几种提取溶剂:甲醇、正己烷、环己烷、95%乙醇、乙酸乙酯及甲醇-三氯甲烷混合溶剂。实验发现，环己烷及乙酸乙酯对6种木脂素提取效率都较低，不能满足方法要求;其它4种提取溶剂对几种木脂素成分皆有较高的提取效率，其中95%乙醇虽然对五味子醇甲提取率最高，但对其它目标组分提取率较低，(见表2)。综合考虑，最后选择正己烷作为6种木脂素的提取溶剂，能够保证所有目标组分都有较高的提取效率。

表2 6种提取溶剂的提取效率(mg/g)Table 2 Effect of different extraction solvents(mg/g)

图1 采用MRM模式分析6种木脂素标样(0.05 mg/g)的总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of 6 lignans(0.05 mg/g)monitored by MRM transitions

2.3 LC-ESI-MS/MS分析木脂素的方法评价

在上述实验条件下测定6种目标组分的标准溶液，以峰面积为纵坐标，标准溶液的浓度为横坐标作图，线性浓度范围为0.005～10.0 mg/g:确定了6种目标组分的检测限(S/N=3)、定量限(S/N=5)、线性方程及线性相关系数(见表3)。目标组分的定量限为4.0×10-4～1.5 ×10-3mg/g，检测限为 2.5 ×10-4～9.0×10-4mg/g，本文所建立的6种木脂素测定方法完全可以满足实际样品中目标组分的检测要求。

图2 采用HPLC-DAD分析6种木脂素标样(0.05 mg/g)的色谱图Fig.2 Chromatogram of 6 lignans standard solutions(0.05 mg/g)analysed by HPLC-DAD

采用回收率试验进行方法评价，准确称取已知含量样品作为空白基质，分别定量加入6种木脂素标准溶液(添加浓度分别为 0.5，2.0，5.0 mg/g)，然后按照实验方法进行提取和分离检测。每个添加水平进行6次重复试验，测得添加6种目标组分的平均回收率为81.01% ～ 92.45%，RSD 为3.05% ～7.98%，因此，本方法具有很高的准确度和精密度。

表3 LC-ESI-MS/MS联用方法分析6种木脂素的定量限、检测限及线性相关系数Table 3 Limits of quantification(LOQ)，limits of detection(LOD)and correlation coefficients of 6 lignans analysed by LC-MS/MS

2.4 实际样品测定

将实验中所建立的五味子木脂素提取方法和分离检测方法应用于20批五味子果实中的木脂素测定，实际样品测定质谱总离子流图见图3，液相色谱-紫外谱图见图4。本方法提供了两种定性方法:通过液相色谱-紫外方法可获得样品中各组分的保留时间信息、通过质谱可得到各组分的监测离子对及其它子离子信息。通过这两种方法可对实际样品的组分进行定性，确定在所有批次样品中同时含有6种待测目标组分:其中五味子醇甲含量为6.67±0.33 mg/g，五味子醇乙2.80 ±0.14 mg/g，五味子酯甲0.83 ±0.05 mg/g，五味子甲素 1.21 ±0.07 mg/g，五味子乙素 3.81 ±0.18 mg/g，五味子丙素 0.90±0.06 mg/g。

3 结论

本实验建立了LC-MS/MS法测定五味子果实中6种木脂素成分，该方法样品前处理简单、提取效率高、分离效果好、完全排除了其它成分对目标组分的定性和定量分析干扰。采用该方法对五味子果实进行分析，确定了其中6种木脂素成分的含量，结果表明在北五味子果实中五味子醇甲含量最高，五味子酯甲含量最低。本研究为建立五味子药材的质量分析方法提供了参考依据、为五味子药材的充分利用提供有力的技术支持。

1 Ikeya Y，Taguchi H，Yosioka I.The constituents of Schizandra chinensis Baill.X.The structures of c-schizandrin and four new lignans，(-)-gomisins L1 and L2，(± )-gomisin M1 and(+)-gomisin M2.Chem Pharm Bull，1982，30:132-139.

2 Ikeya Y，Taguchi H，Yosioka I.The constituents of Schizandra chinensis Baill XII Isolation and structure of a new lignan，gomisin R，the absolute structure of wuweizisu C and isolation of schisantherin D.Chem Pharm Bull，1982，30:3207-3211.

3 Ikeya Y，Taguchi H，Mitsuhashi H，et al.A lignan from Schizandra chinensis.Phytochem，1988，27:569-573.

4 Ikeya Y，Miki E，Okada M，et al.Benzoylgomisin Q and benzoylgomisin P，two new lignans from Schisandra sphenanthera Rehd.Et Wils.Chem Pharm Bull，1990，38:1408-1411.

5 Aiken C，Chen CH.Betulinic acid derivatives as HIV-1 antivirals.Trends Mol Med，2005，11:31-36.

6 Muhanji CI，Hunter R.Current developments in the synthesis and biological activity of HIV-1 double-drug inhibitors.Curr Med Chem，2007，14:1207-1220.

7 Zheng CY(郑春英)，Li HT(李宏涛)，Wu T(吴桐)，et al.Simultaneous Determination of schizandra，deoxyschizadra and γ-schizandra in Different Parts of Schisandra chinensis(Turcz.)Baill by HPLC.Food Sci(食品科学)，2007，28:376-379.

8 Yin GX(阴冠秀)，Du B(杜冰)，Lu WW(鲁旺旺)，et al.Determination of lignins in Schisandra sphenanthera and Schisandra chinensis by high performance liquid chromatography.Food Sci(食品科学)，2011，32:218-221.

9 Zhang H，Zhang GQ，Zhu ZY，et al.Determination of six lignans in Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.Fruits and related Chinese multiherb remedies by HPLC.Food Chem，2009，115:735-739.

10 Lee HJ，Kim CY.Simultaneous determination of nine lignans using pressurized liquid extraction and HPLC-DAD in the fruits of Schisandra chinensis.Food Chem，2010，120:1224-1228.

11 Huang X，Song FR，Liu ZQ，et al.Studies on lignan constituents from Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.fruits using high-performance liquid chromatography/electrospray ionization multiple-stage tandem mass spectrometry.J Mass Spectrom，2007，42:1148-1161.

12 Yang LQ(仰榴青)，Xu ZQ(徐佐旗)，Wu XY(吴向阳)，et al.Simultaneous determination of the four lignans in extract of Schisandra chinensis and S.sphenanthera by TLCS.Food Sci(食品科学)，2006，27:401-404.