比较卡铂对乳腺癌细胞及血小板生成素作用下巨核细胞的影响

李自健，杨俊兰，焦顺昌，张 帆，谢文秀，游俊浩

1解放军第161医院 肿瘤内科，湖北武汉 430012；2解放军总医院 肿瘤内科，北京 100853；3海军总医院特需医疗部，北京 100037

恶性肿瘤患者化疗后常导致不同程度的血小板减少，以往临床多采用输血小板，目前临床常在化疗后使用血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)来治疗[1-8]，但起效较慢[7]。国外有研究在化疗前使用血小板生成素[9]，但目前临床上对此有些担心，是否会加重化疗药物对巨核细胞的抑制以及是否安全。本实验通过观察化疗药物卡铂对乳腺癌细胞和使用TPO的巨核细胞的抑制率比较，模拟临床上化疗前使用TPO化疗药物对巨核细胞和肿瘤细胞的影响，间接了解化疗前使用TPO是否安全。

材料和方法

1 主要材料 TPO(沈阳三生1ml：15 000U)，卡铂注射液(齐鲁公司10ml：100mg)，天津血研所提供的巨核细胞株MO7e细胞、解放军总医院肿瘤实验室提供的人乳腺癌细胞系MDA-MB-453。

2 细胞培养 把MO7e细胞培养在RPMI-1640培养基中(含10%胎牛血清和浓度20ng/ml的TPO)，在CO2培养箱中培养。人乳腺癌细胞系MDA-MB-453培养在RPMI-1640中(含10%胎牛血清)，在CO2培养箱中培养。

3 TPO不同浓度对MO7e细胞的影响 取MO7e细胞，把细胞浓度调为2×105/ml，把细胞分10组，每组5个复孔，接种在96孔板中，浓度为每孔2×104/100μl，分别加入0、4、8、16、32、64、128、256、512μg/L浓度的TPO，相同方法重复接种3个96孔板，各培养24h、48h、72h，然后每孔加入MTT 20μl，4h后每孔加入100μl二甲基亚砜(DMSO)，使用酶标仪于492nm波长处测定吸光度值(A)，计算MO7e细胞增殖率。公式=(实验组A值-对照组A值)/对照组A值×100%，作出增殖曲线，以上实验全部重复3次。

4 卡铂对加入TPO的MO7e细胞的抑制率 取MO7e细胞，洗涤2次，悬浮于RPMI-1640培养基中(含10%胎牛血清和256ng/ml的TPO)，细胞浓度调为2×105/ml。把细胞分成9组，每组6个复孔，浓度为2×104/100μl/孔接种在96孔板中，分别加入0到2 000μg/ml浓度的卡铂，相同方法重复接种2个96孔板，各培养24h和48h后，然后每孔加入MTT 20μl，4h后每孔加入100μl的DMSO，使用酶标仪于492nm波长处测定吸光度值(A)，计算抑制率。公式=1-(实验组A/对照组A)，作出卡铂对MO7e细胞作用曲线，以上实验全部重复3次。

5 卡铂对乳腺癌细胞系的抑制率 取乳腺癌细胞，细胞浓度为1.5×105/ml，分成7组，每组设6个复孔，浓度为1.5×104/100μl/孔接种在96孔板中，培养24h细胞贴壁后，1-7组分别加入0到800μg/ml浓度的卡铂，相同方法重复接种2个96孔板，各培养24和48h后，每孔加入MTT 20μl，4h后弃上清，每孔加入150μl的DMSO，使用酶标仪于492nm波长处测定吸光度值(A)，计算抑制率。作出卡铂对乳腺癌细胞作用曲线，以上全部实验重复3次。

6 统计学方法 实验数据采用-x±s表示，用SPSS17.0软件统计处理数据，相关性检验使用秩和相关检验，多组间比较使用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 TPO浓度变化对MO7e细胞的影响 MO7e细胞增殖率随TPO浓度增大而增大，TPO浓度达到256ng/ml时，细胞的增殖率达到最大，同时也达到平台期，浓度达到512ng/ml时细胞增殖率不再增大，取256ng/ml为TPO实验浓度。见图1。

2 卡铂对MO7e细胞的抑制率 随着卡铂浓度增大，对MO7e细胞的抑制率也增加，呈正相关。各实验组的抑制率与对照组(卡铂浓度为0μg/ml)相比P<0.01，同时作图求得卡铂对MO7e细胞的IC50，作用24h后IC50=4 000μg/ml，作用48h后IC50=1 600μg/ml，见表1、图2。

3 卡铂对乳腺癌细胞的抑制率 随着卡铂浓度增大，对乳腺癌细胞的抑制率也增大，呈正相关。各实验组的抑制率与对照组(卡铂浓度为0μg/ml)相比P<0.01，作图求得卡铂对乳腺癌细胞的IC50，作用 24h后 IC50=400μg/ml，作用 48h后IC50=120μg/ml，见表2、图3。

4 卡铂对MO7e细胞和乳腺癌细胞的抑制率比较卡铂对乳腺癌细胞的IC50远远小于对MO7e细胞的IC50，差异达10倍左右，表明卡铂对乳腺癌细胞的抑制率远远大于对MO7e细胞的抑制率，见表3。

表1 卡铂作用24h和48h对MO7e细胞抑制率变化Tab 1 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MO7e cells at 24 and 48h(-x±s, n=6)

表2 卡铂作用24h和48h对乳腺癌细胞抑制率变化Tab 2 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MDAMB-453 cells at 24 and 48h(-x±s, n=5)

表3 卡铂对MO7e细胞和乳腺癌细胞的IC50比较Tab 3 Effect of CBP on IC50 of MO7e cells and MDA-MB-453 cells(μg/ml)

图1 加入TPO 不同时间细胞增殖率的变化Fig 1 Effect of TPO on proliferation rate of MO7e cells at different time points

图2 卡铂作用24h和48h对MO7e细胞抑制率变化Fig 2 Inhibitory effect of CBP on proliferation rate of MO7e cells at 24 and 48h(-x±s, n=6)

图3 卡铂作用24h和48h对乳腺癌细胞抑制率变化Fig 3 Inhibitory effect of CBP on proliferation of MDA-MB-453 cells at 24 and 48h(-x±s, n=5)

讨 论

本实验用MO7e巨核细胞株替代巨核细胞，MO7e细胞能表达血小板特异性的表面标志物，其表面有TPO受体c-Mpl，并且其生长需TPO支持。人类骨髓中巨核细胞数量非常少，通过实验方法分离和纯化比较困难，并且不易在体外长期培养，因此MO7e细胞株替代巨核细胞，目前是最佳研究TPO对巨核细胞影响的替代细胞[10]。

本实验观察到TPO能促进巨核细胞增殖，呈浓度依赖性，TPO浓度256ng/ml时达到平台期。通过卡铂对乳腺癌细胞以及对加入TPO的巨核细胞IC50比较，卡铂对乳腺癌细胞的抑制率远远大于对加入TPO巨核细胞的抑制率，提示化疗前使用TPO可能是比较安全的。因本实验是体外实验，与体内实验尚有一定差距，还需进一步临床实验。

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9 Vadhan-Raj S，Patel S，Bueso-Ramos C，et al. Importance of predosing of recombinant human thrombopoietin to reduce chemotherapy-induced early thrombocytopenia［J］. J Clin Oncol，2003，21（16）：3158-3167.

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