早孕期完整胚胎切片的制备方法

乔江丽，赵恩锋，彭红梅，宋 欣，陈 薇，邓晋芳，田 侠

解放军总医院，北京 100853 1妇产科；2病理科

人类生殖器官和生殖细胞起源、发育的机制研究一直是生命科学中重要的研究课题。随着国内外辅助生殖技术的不断发展与应用，越来越多有关人类胚胎生殖系统发育方面的研究探索相继开展。由于人胚的研究受到伦理、道德、宗教等诸多方面的制约，研究相对缓慢。20世纪后期美国学者Moore等[1]在研究人胚胎早期发育方面(从受精卵到胚胎形成及各系统的早期发育过程)取得了很大进展。丹麦学者Mollgard等[2]在探索生殖系统发育的祖细胞(即生殖细胞)的迁移等方面也取得初步进展。研究胚胎生殖系统发育过程依赖基本的病理技术操作，目前人类早期胚胎完整切片的制作方法及切片的镜下特征等在国内外研究领域还是空白，生殖脊早期发育阶段的形态特征还没有报道。我们制作早期胚胎切片，目的是为今后研究人类生殖脊的起源、早期阶段的形态特征和生殖细胞的起源、迁移等提供技术支持。现将人类早期胚胎完整切片的制备过程报告如下。

材料和方法

1 胚胎的收集 经我院伦理委员会批准，征得孕妇同意，经签署知情同意书。收集胎龄约为21-35d药物流产胚胎。所用药物对胚胎组织标本的制作无影响，且所用药物流产胚胎均为已经死亡的胚胎。所选早孕妇女均经B超检查确认为正常宫内早孕且尿妊娠阳性。胚胎龄的计算方法：选择平素月经规律、周期为28-30d的早孕孕妇，按孕妇末次月经日减去14d，并结合胚胎发育的外部特征计算胎龄。

2 取材与固定 所有药物流产的完整胚胎直接用4%甲醛固定。将胎囊在解剖显微镜下解剖，找到胎芽及卵黄囊，除去多余绒毛膜囊，取出完整胎芽及卵黄囊，滤纸包裹标记好方向及体位。进行常规脱水 (经 50%，70%，80%，90%，100%等梯度乙醇脱水)，二甲苯浸透，浸蜡(置于56-60℃熔化的石蜡中2-3h，使石蜡充分渗透组织内部)，液体石蜡包埋，切片与HE染色等步骤。光镜下观察人类早期胚胎形态结构特征并照相。

结 果

1 切片制备情况 药流囊胚55例采用此方法制备胚胎完整切片，成功30例(成功率为55%)。剩余制备失败的25例中有17例胎囊中未见到胎芽，8例由于胎芽过小过嫩，在进行夹取固定或石蜡包埋时组织遭到损坏，以至镜下观察时结构不典型，难以辨认。

2 大体标本 显微镜下大体标本可见完整胚胎及卵黄囊，胚胎呈新月状，凹面为腹侧，凸面为背侧。腹侧从上至下依次为头部，心脏等结构；侧面可见胚胎上肢芽和下肢芽；背侧清晰可见脊柱成串排列。胚胎下方为圆形近透明的卵黄囊。见图1。

3 HE染色镜下形态结构 切片干净，完整，能清楚辨认出胎儿头部、心脏、肝脏等器官，脊柱成串排列，其他内脏器官如肾脏、生殖器官等(泌尿生殖嵴等还未开始发育)还未生成；卵黄囊呈不规则圆形。见图2。

图1 30d人胚胎镜下大体标本(×12)蓝色箭头指示卵黄囊，红色箭头指示胎儿头部，蓝色三角指示心脏，红色三角分别指示上下肢芽，黑色箭头指示脊椎。图2 30d人胚胎石蜡切片HE染色镜下形态结构(×13)蓝色箭头指示卵黄囊，红色箭头指示头部，红色三角指示心脏区，黑色箭头指示脊椎。Fig 1 Gross human embryo on day 30 of fertilization(original magnification ×12)Blue arrow indicates yolk sac, red arrow indicates fetal head, blue triangle indicates heart, red triangle indicates anterior limb bud and posterior limb bud, black triangle indicates vertebral column.Fig 2 Morphology of embyo on day 30 of fertilization after HE staining(original magnification ×13)Blue arrow indicates yolk sac, red arrow indicates fetal head, red triangle indicates heart, black triangle indicates vertebral column.

讨 论

有关人类早期胚胎的认识及各阶段形态特征的研究国外学者研究的较早，并取得了很大的成果[2]。在人类早孕期胚胎完整切片的制备方面有其独特的方法，他们把胎龄为28-56d大小的人胚胎行磁共振成像摄片[3]，对人类早期胚胎生殖系统及内外生殖器官发育进程也有研究[4]。而国内目前主要集中于对鼠胚的研究，2003年有小鼠早期胚胎细胞切片制备的报道[5]，2004年刘晓蓉等报道采用石蜡切片完成对鼠胚生殖腺发育的形态学观察研究[6]，2005年刘淑琴等报道制备出鼠胚不同阶段的完整切片[7]，2009年制备出含中肾旁管的小鼠胚胎组织石蜡切片[8]。有关人早期胚胎的完整切片制备基本上还是一片空白，无相关报道。在用石蜡包埋制备完整人胚蜡块的方法成功应用之前，我们也曾试过用琼脂糖固定胚胎[9]，试图精修后做石蜡切片，但是由于琼脂糖的透明度及软硬度不能达到满意效果，不得不继续寻找其他可行方法。

经过对此方法反复实验研究，得出在进行人类早期胚胎切片的制备过程中需注意以下操作：1)要借助光源找到绒毛膜囊内的胎芽和卵黄囊，没有光源很容易将其与绒毛组织混淆，甚至无法辨认；2)早孕期胎芽较小较嫩，操作必须非常轻柔仔细，否则极易将卵黄囊和胎芽破坏，失去其完整性；3)在用滤纸包裹固定时，不能直接夹取胎芽或卵黄囊，最好留一小部分绒毛膜囊便于操作；4)浸蜡后的包埋操作同样要轻柔、仔细，认真辨认，避免直接夹取胎芽和卵黄囊组织。总之，整个过程一定要非常轻柔、仔细，才可能确保胎芽和卵黄囊的完整性，也才可能得到完整的切片。切片制作成功率不是很高，一方面由于胚胎本身发育障碍所致只有空胎囊而没有胎芽发育；另一方面由于早孕期胎芽组织极其脆嫩，给操作带来很大不便，需要熟练的操作技术；另外操作时间过长也会影响胚胎组织的质量。

人类胚胎石蜡标本的制备，解决了标本保存的时间问题，可多次切片，简单易行，对研究人类胚胎发育和辅助生殖技术都有重要意义。在今后的研究工作中，我们会不断改良方法，制备出更好的人类胚胎发育各个阶段的完整切片，以便观察生殖器官的发育情况及形态变化特征。

致谢：妇产科赵玉梅、宋东芳、孙继荣等医学同仁，为我们的工作提供了很大的帮助和支持，在此向她们表示感谢！

1 Moore KL，Persaud TVN. Before we are born ：essentials of embryology and birth defects［M］. 4th. Philadelphia：Saunders，1993：26-299.

2 Mollgard K，Jespersen A，Lutterodt MC，et al. Human primordial germ cells migrate along nerve fibers and Schwann cells from the dorsal hind gut mesentery to the gonadal ridge［J］. Molecular Human Reproduction，2010，16（9）：621-631.

3 Matsuda Y，Ono S，Otake Y，et al. Imaging of a large collection of human embryo using a super-parallel MR microscope［J］. Magn Reson Med Sci，2007，6（3）：139-146.

4 Sajjad Y. Development of the genital ducts and external genitalia in the early human embryo［J］. Obstet Gynaecol Res，2010，36（5）：929-937.

5 吕广艳，曲淑贤，申 健，等. 小鼠早期胚胎细胞超薄切片制备法［J］. 大连医科大学学报，2003，25（1）：63-64.

6 刘小蓉，安靓，李进. 昆明胚鼠生殖腺发育的形态学观察［J］.第一军医大学学报，2004，24（4）：414-418.

7 刘淑琴，秦建民，曾锦章，等. 不同时期小鼠胚胎整体石蜡标本的制备技术［J］. 解剖学杂志，2005，28（6）：721-723.

8 梁琳琳，朱桂金. 含有中肾旁管的小鼠胚胎组织石蜡切片制备［J］. 新乡医学院学报，2009，26（1）：1-3.

9 屈平平，田文儒，高善颂，等. 小鼠附植前胚胎超薄切片的琼脂糖预包埋制备方法［J］. 中国兽医科学，2008，38（3）：254-256.