Villin蛋白的表达及其与贲门腺癌的关系

肖中岳，孙江涛，茹 艺，高社干，王玉峰，冯笑山，王立东

(1.河南科技大学第一附属医院肿瘤科、河南科技大学肿瘤研究所，河南洛阳471003;2.河南省食管癌重点开放实验室，河南郑州450052)

贲门腺癌(gastric cardia adenocinoma，GCA)是指上端胃临近食管部位发生的腺癌，自其被认为与胃癌有不同的病理学特征而是一种独立的疾病以来，其发病率呈逐年上升趋势，是增长速度最快的恶性肿瘤之一［1］。与胃窦肠化及Barrett’s食管类似，贲门黏膜肠化被认为是GCA发生过程中的重要环节，对贲门肠化的深入研究有助于揭示GCA发生、发展的演进过程，从而为GCA的早期诊断提供理论依据［2］。绒毛蛋白Villin是一种重要的肌动蛋白粘连蛋白，特异性表达于肠道上皮和部分肾上皮细胞的刷装缘［3］。近期研究［4］结果显示Villin蛋白在Barrett’s食管组织中异常表达，是检测Barrett’s食管的有效指标。但Villin蛋白与贲门肠化及GCA发生、发展的关系尚不明确。本研究通过测定Villin蛋白在贲门各级癌前肠化组织及GCA组织中的表达，探讨Villin蛋白在贲门肠化中的作用及其与GCA发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 入选组织包括胃镜活检及手术切除的GCA及癌旁肠化组织共128例，均来自中国贲门癌高发地区，其中贲门肠化组织25例，男性19例，女性6例，平均年龄(47.5±12.3)岁;贲门肠化伴不典型增生组织48例，男性30例，女性18例，平均年龄(60.4±7.7)岁;GCA组织55例，男性45例，女性10例，平均年龄(59.4±9.3)岁，患者术前均未接受放疗和化疗。同时选取该地区15例胃镜普查正常贲门组织作为对照。

1.2 主要试剂 Villin蛋白(兔源多克隆抗体，BS-0535R，工作浓度1∶150)一抗、PV9000 S-P试剂盒、DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 组织制作 每例组织均经850 mL·L－1乙醇固定，常规石蜡包埋，4 μm续切4张，第1张行常规HE染色，第2张做Villin蛋白免疫组织化学染色，另2张备用。

1.4 免疫组织化学染色 严格按照PV9000 S-P试剂盒说明进行操作。采用EDTA(pH 8.0)微波热修复，一抗孵育条件:4℃放置＞15 h。为排除假阳性和假阴性，采用已知阳性片为阳性对照和PBS代替一抗设为阴性对照。

1.5 结果判定 Villin蛋白主要表达于肠化上皮细胞的刷状缘，在GCA组织中呈弥漫性表达。结果判定采用半定量法。阳性结果为细胞质或细胞核中出现清晰的棕黄色颗粒，先在低倍镜下观察，后随机读取5个高倍视野下的阳性细胞数，将阳性细胞计数分为4个等级，分别为:无阳性细胞计0分，≤25%计1分，26% ～50%计2分，51% ～75%计3分，＞75%计4分;并将着色强度分为3个等级分别为:无色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。最后将2项评分相乘，得出结果并分为4个等级:0分为阴性(－)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为中度阳性(++)，＞4分为强阳性(+++)。

1.6 统计学处理 采用SPSS 17.0进行数据分析，定性变量的比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 Villin蛋白在不同贲门组织中的表达 Villlin蛋白在正常贲门组织中无染色;在贲门肠化组织中主要表达于杯状细胞刷装缘，染色呈棕黄色;在GCA组织中主要表达于细胞浆中，呈棕黄色。Villin蛋白在正常贲门组织中无阳性表达，在贲门肠化组织中的阳性表达率为76.0%(19/25)，肠化伴不典型增生组织中的阳性表达率为60.4%(29/48)，GCA组织中的阳性表达率为36.4%(20/55)，比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见图 1、表1。

2.2 Villin蛋白表达与GCA患者临床病理学特征的关系 Villin蛋白表达与GCA患者临床病理学特征的关系见表2。

3 讨论

贲门肠化在GCA发生中的作用日益受到重视。Siewert等［5］和 McColl［6］总结以往的研究后发现，贲门肠化是GCA的重要癌前病变。由于受到幽门螺杆菌感染和胃食管反流的长期刺激，贲门肠化发生率极高，从而进一步导致了GCA的高发生率。而国内学者［7］对中国河南贲门癌高发区GCA及癌旁组织中肠化情况研究发现，该地区GCA癌旁组织肠化发生率明显低于西方国家，但明显高于该地区正常人群，提示贲门肠化与GCA的发生、发展密切相关。贲门肠化很可能是GCA的早期病变，对贲门肠化的深入研究有助于揭示GCA发生、发展的演进过程，从而为GCA的早期诊断提供理论依据。

Villin蛋白是一种具有多种功能的钙离子依赖肌动蛋白粘连蛋白，通常以单体形式出现，相对分子质量为 95 000［8－9］，主要表达于小肠绒毛细胞的刷状缘［3］。Villin蛋白是肠道细胞分化成熟的标志，也是消化道肿瘤的重要肿瘤标志物［10］。赵成波等［11］研究发现Villin蛋白在胃黏膜肠化组织中出现了异常高表达，Weimann等［12］研究发现Villin蛋白的异常表达同样出现在Barrett’s食管组织中，这提示Villin蛋白很可能参与了这些部位肠化的发生。与之相近，本研究结果显示Villin蛋白在正常贲门组织中无表达，而在贲门的癌前肠化组织中出现异常高表达，提示Villin蛋白的异常表达是贲门肠化发生的重要早期事件。

表1 Villin蛋白在不同贲门组织中的表达 n(%)

表2 Villin蛋白表达与GCA患者临床病理学特征的关系 n(%)

Villin蛋白作为重要的细胞结构蛋白，在维持肠上皮表型中发挥重要作用［13］。有研究［14］发现，Villin蛋白在肠道肿瘤发生中出现表达率及表达位置的改变，这些改变受CDX2蛋白的调控，是导致肠上皮细胞失分化的重要因素。赵成波等［11］的研究结果也显示，Villin蛋白在胃肠化组织中的表达明显低于胃不典型增生及胃癌组织，且在各级不典型增生组织中的表达差异有统计学意义，提示Villin蛋白在维持胃黏膜肠化上皮结构中发挥重要作用。本研究中，Villin蛋白在贲门肠化组织、肠化伴不典型增生组织至GCA组织的发展过程中其阳性表达率逐渐下降，且在该过程中伴有表达位置出现空间和时间上的转变，随着分化程度的逐步改变，该蛋白表达的位点及强度发生改变，在贲门肠化组织中Villin蛋白主要表达于杯状细胞刷状缘，染色较强，而在肠化伴不典型增生组织及GCA组织中呈弥漫性表达且染色强度也较弱。本研究还发现Villin蛋白表达有随肿瘤细胞分化程度的下降而下降的趋势。以上结果均提示，在癌变过程中Villin基因发生了改变，从而导致Villin蛋白表达异常，进而引起贲门肠上皮表型不能维持，细胞失分化，最终导致了GCA的发生。

综上所述，Villin蛋白可能参与了贲门肠化和GCA的发生，并在GCA的细胞分化中起重要作用。Villin蛋白是检测贲门早期肠化的有效指标，但由于免疫组织化学技术的有限性，Villin蛋白在GCA发生中的具体作用仍需进一步深入研究。

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