嗜热菌Geobacillus sp.PZH1产木聚糖酶发酵条件的优化

刘培培，陈学敏，王石峰，张 波

（北京联合大学应用文理学院，生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京100191）

嗜热菌Geobacillus sp.PZH1产木聚糖酶发酵条件的优化

刘培培，陈学敏，王石峰，张 波*

（北京联合大学应用文理学院，生物活性物质与功能食品北京市重点实验室，北京100191）

对嗜热菌Geobacillus sp.PZH1发酵产嗜热耐碱木聚糖酶的培养条件进行了优化研究。对碳源、氮源、初始pH、接种量以及发酵温度五个因素进行了单因素实验，在此基础上对碳氮比、初始pH以及接种量进行了正交实验。结果表明，该菌株在发酵培养7d时有最大产酶量，Geobacillus sp.PZH1发酵产木聚糖酶最佳发酵条件为：桦木木聚糖为碳源，牛肉膏为氮源，碳氮比2∶3，初始pH7.0，接种量4%，发酵温度50℃，发酵时间7d。在最佳产酶条件下进行发酵，木聚糖酶活力可达2.56IU/mL，是未优化前酶活的1.44倍。

嗜热菌，木聚糖酶，发酵条件

1 材料与方法

1.1 实验材料

Geobacillus sp.PZH1 分离自云南腾冲热泉水样[6]，本实验室保存；桦木木聚糖（Birchwood xylan）、3，5-二硝基水杨酸（DNS） 购自美国Sigma公司；其他试剂 均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基和培养条件

1.2.1.1 培养基 种子培养基：NH4Cl 1g、KCl 0.1g、NaNO31g、MgSO40.2g、Na2HPO40.21g、NaH2PO40.1g、CaCl20.1g、Na2S2O3·5H2O 1g、Na2S·9H2O 0.3g、酵母提取物3g、蛋白胨15g、葡萄糖10g、微量元素液10mL，加水定容至1L，调节pH7.0，1×105Pa灭菌30min。发酵培养基：其他组分与种子培养基相同，仅碳源改为木聚糖，氮源为蛋白胨、胰蛋白胨或牛肉膏，碳源和氮源总含量为3%，pH根据实验设计而定。微量元素液：MnSO40.5g、CuSO4·5H2O 0.01g、FeSO4·7H2O 0.1g、ZnSO4·7H2O 0.5g、CoCl2·6H2O 0.042g，加水定容至1L。1.2.1.2 培养条件 从斜面接入种子培养基，50℃、200r/min恒温培养12h左右，将种子以一定的接种量转接至发酵培养基中，按实验设计恒温振荡培养数天，装液量均为250mL摇瓶装50mL培养基。

1.2.2 酶活性测定 DNS液配制和木糖含量测定：参考文献[7]。酶活性测定[8]：取适当稀释的酶液0.5mL，加入1.5mL 1%木聚糖溶液，于70℃恒温水浴精确反应10min，迅速加入3mL DNS显色液，沸水浴反应12min，冰浴后定容至50mL，于490nm[9]处测吸光度并参照木糖标准曲线求得木糖含量，计算酶活，对照组不经过70℃恒温水浴直接加入DNS显色液反应。酶活性单位定义：每分钟产生1μmoL还原糖（以木糖计）所需的酶量为一个酶活性单位，以IU/mL表示。

酶活计算公式：E=nC×1000/MT

其中：E：酶活（IU/mL）；n：稀释倍数；C：木糖含量（mg/mL）；M：木糖分子量（150）；T：反应时间（min）。

1.2.3 产酶历程 将培养至对数期的种子按2%接种量转接至发酵培养基中，50℃、200r/min恒温培养，每天定时取样测定发酵液中木聚糖酶的酶活，确定最佳产酶收获期。

1.2.4 单因素实验 以7d木聚糖酶的产量为指标，分别对碳源、氮源、初始pH、接种量以及发酵温度做单因素实验，研究它们对菌株产酶的影响。

1.2.4.1 不同碳源对产酶的影响 发酵培养基碳源分别为桦木木聚糖、玉米芯木聚糖、麦麸和玉米芯粉末，浓度为10g/L。

1.2.4.2 不同氮源对产酶的影响 发酵培养基氮源分别为蛋白胨、胰蛋白胨和牛肉膏，浓度为15g/L。

1.2.4.3 不同初始pH对产酶的影响 以桦木木聚糖为碳源和牛肉膏为氮源配制发酵培养基，初始pH分别为5、6、7、8、9。

1.2.4.4 不同接种量对产酶的影响 以桦木木聚糖为碳源和牛肉膏为氮源配制发酵培养基（pH7），接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%。

1.2.4.5 不同发酵温度对产酶的影响 发酵温度分别为40、50、60、70℃。

1.2.5 正交实验 在单因素实验的基础上，选择接种量（A）、碳氮比（B）和初始pH（C）三个影响因素，选用L9（34）正交实验设计表进行正交实验，测定培养7d时木聚糖酶的酶活产量以确定最佳发酵条件。因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

2 结果与讨论

2.1 产酶历程

通过产酶历程研究，确定Geobacillus sp.PZH1产木聚糖酶的最佳收获时间。从图1可以看出，该菌在培养第7d时，所产酶量最大，故选择第7d为该菌产木聚糖酶的收获期。

图1 木聚糖酶产酶历程Fig.1 The course of xylanase production

2.2 单因素实验

2.2.1 不同碳源对产酶的影响 碳源是微生物的主要能量来源，且为微生物合成产物提供碳架。微生物对不同种类的碳源利用能力不同，合成产物量也不同。由图2可以明显看出，桦木木聚糖为碳源时，产酶量最高，其次为玉米芯木聚糖，以玉米芯粉末为碳源时，产酶量最少，因此最佳碳源确定为桦木木聚糖。该菌基本不能利用玉米芯粉末产木聚糖酶，可能的原因是该菌优先利用了玉米芯粉末中的葡萄糖等单糖，抑制了木聚糖酶的表达，或者是玉米芯粉末中木聚糖被其他纤维素等大分子物质包裹或相互结合在一起，致使无法诱导该菌产木聚糖酶。玉米芯是农业废弃物，以玉米芯为原料生产木聚糖酶可以降低成本。考虑到现实经济条件，玉米芯木聚糖也是一种比较理想的碳源。

图2 碳源对木聚糖酶产量的影响Fig.2 Effect of carbon source on xylanase production

2.2.2 不同氮源对产酶的影响 氮源由于氨基酸组成不同，其被微生物利用的程度以及对产酶的影响均不同，从图3可知，氮源为牛肉膏时，产酶量最大，而为蛋白胨和胰蛋白胨时，产酶量都比前者低。因此确定最佳氮源为牛肉膏。

图3 氮源对木聚糖酶产量的影响Fig.3 Effect of nitrogen sourse on xylanase production

2.2.3 不同初始pH对产酶的影响 初始pH对微生物生长有产生直接影响，进而影响产物形成。本实验考察初始pH范围5~9对产酶情况的影响，从图4可知，当pH＜7时，随着初始pH的升高产酶量逐渐增大，当pH> 7时，产酶量随pH的升高而呈现减小趋势，在pH在7左右时，达到最大产酶量。因此确定最佳初始pH约为7。

图4 初始pH对木聚糖酶产量的影响Fig.4 Effect of initial pH on xylanase production

2.2.4 不同接种量对产酶的影响 接种量对微生物的生长和产物常量都有一定影响，大接种量可以缩短微生物的生长延迟期，使产物提前产生，但可能会引起溶氧量减少影响产物合成；小接种量则会延长培养时间，降低发酵生产率。本实验采用2%~10%的接种量进行研究，从图5可知，接种量为4%时，产酶量最大，其次为2%，接种量为6%、8%、10%时，产酶量相差不大，因此确定最佳接种量为4%。

图5 接种量对木聚糖酶产量的影响Fig.5 Effect of inoculum size on xylanase prodyction

2.2.5 不同发酵温度对产酶的影响 发酵温度是一个至关重要的环境因子，因为它关系着微生物的细胞组成成分以及大部分的生化反应。发酵温度不同，微生物的生长以及产生的代谢产物均有不同程度的变化。从图6可知，发酵温度为40、60、70℃时，酶产量很低，且40℃时，该菌基本不产酶，在50℃时，产酶量最大，故最佳发酵温度为50℃。

图6 发酵温度对木聚糖酶产量的影响Fig.6 Effect of temperature on xylanase production

2.3 正交实验

正交实验设计及其结果见表2，决定产酶量的影响因子顺序为C>B>A；产酶条件的最优因子组合为A3B3C2。对A2B3C2及A3B3C2进行重复验证实验，得到7d酶活分别为2.56、2.43IU/mL，由此可见，A2B3C2即碳氮比2∶3、初始pH 7.0、接种量4%是最佳发酵条件，酶活是未优化时酶活的1.44倍。因此，该菌发酵产木聚糖酶的最佳发酵条件为：碳源为桦木木聚糖，氮源为牛肉膏，碳氮比2∶3，初始pH7.0，接种量4%，发酵温度50℃，培养7d产酶量达最高。

表2 正交实验结果Table 2 The result of orthogonal experiment

3 结论与讨论

通过单因素实验确定了Geobacillus sp.PZH1产木聚糖酶的最佳碳源为桦木木聚糖，最佳氮源为牛肉膏，最佳初始pH为7.0，最佳接种量为4%，最佳发酵温度为50℃；选取碳氮比、初始pH和接种量三个因素，设计三因素三水平正交实验，确定最佳发酵条件组合为：碳氮比2∶3、初始pH 7.0、接种量4%。所以，Geobacillus sp.PZH1发酵产木聚糖酶的最佳发酵条件为：碳源（桦木木聚糖）∶氮源（牛肉膏）为2∶3、初始pH7.0、接种量4%、发酵温度50℃，发酵时间7d，酶产量为2.56IU/mL，是未优化前酶活的1.44倍。

尽管通过条件优化，木聚糖酶产酶水平有了一定提高，但是相对于目前一些高产木聚糖酶真菌而言，该嗜热菌与它们之间的酶产量有较大的差异[10-11]，制约了该菌在工业上的应用。不过近年来随着分子生物学快速广泛的发展，利用基因工程手段将高应用价值以及具有特殊酶性质的酶基因克隆并在工程菌中进行高效表达[12-14]弥补了天然菌株产酶量低的缺点。

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Optimization of fermentation conditions of xylanase from thermophilic bacterium Geobacillus sp.PZH1

LIU Pei-pei，CHEN Xue-min，WANG Shi-feng，ZHANG Bo*
（College of Arts and Sciences，Key Laboratory of Biological Active Materials and Functional Food，Beijing Union University，Beijing 100191，China）

The culture conditions for alkali-thermo-stable xylanase production from the thermophilic bacterium Geobacillus sp.PZH1 were optimized.Five factors，such as carbon source，nitrogen source，initial pH，inoculum size and fermentation temperature，were researched in single-factor experiment.C/N ratio，initial pH and inoculum size were researched in orthogonal experiment.The results showed that the xylanase yield reached a highest level for 7d culture，and the best combination of fermentation conditions for alkali-thermo-stable xylanase production from the thermophilic bacterium Geobacillus sp.PZH1 was brichwood xylan as carbon source，beef extract as nitrogen source，C N ratio 2∶3，initial pH 7.0，inoculum size 4%，fermentation temperature 50℃ and fermentation time 7d.Under these optimal conditions，the xylanase production from the thermophilic bacterium Geobacillus sp.PZH1 was 2.56IU/mL，1.44 fold higher than that before the optimization.

thermophilic bacterium；xylanase；fermentation condition

TS201.3

A

1002-0306（2012）07-0154-04

木聚糖是木料中存在的最主要的半纤维素，同时也是一种重要的可再生资源。它由β-D吡喃型木糖残基经过β-1，4-糖苷键连接形成碳链骨架，支链由乙酰基甘露糖等基团连接形成[1]。完全降解木聚糖需要多种酶的共同协作，其中最关键的降解酶是内切β-1，4-木聚糖酶与β-木糖苷酶，前者主要内切于木聚糖主链的β-1，4-木糖苷键，产生不同聚合度的木寡糖和很少量木糖，而后者则主要作用于木寡糖的末端，释放出木糖。目前研究较成熟的是常温木聚糖酶，由于常温木聚糖酶本身性质无法满足工农业的某些特殊要求而限制了其应用，因此嗜热、耐碱、耐酸等具有特殊性质的木聚糖酶[2-5]成为目前研究的热点，该类木聚糖酶可广泛应用于食品、饲料、造纸与生物转化等行业。本实验室从腾冲热泉水样中分离得到一株嗜热菌，经鉴定命名为Geobacillus sp. PZH1，该菌能分泌一种耐热耐碱木聚糖酶，在食品与造纸等行业中具有潜在应用价值。本研究利用单因素和正交实验方法对Geobacillus sp.PZH1产酶发酵条件进行了优化研究。

2011－06－14 *通讯联系人

刘培培（1987-），女，在读硕士，研究方向：生物活性物质的功能与毒理。

国家重点基础研究发展计划（973计划）资助项目（2007CB707805）。