6-BA对黑麦草愈伤组织诱导影响的初步研究

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(湖南农业大学农学院草业科学系，湖南长沙 410128)

6-BA对黑麦草愈伤组织诱导影响的初步研究

吴莲蓉，徐庆国*，李洪，武羿君，黄萍，张婷，赵鑫，李斌，高伟

(湖南农业大学农学院草业科学系，湖南长沙 410128)

为了确立最佳的黑麦草再生体系，选用多年生黑麦草雅晴、沃土和一年生黑麦草特高等3个不同黑麦草品种的成熟种子为外植体，分别采用CC，MS，NB，N6等4种基本培养基，在每种培养基中分别加入5 mg/L的2,4-D和0，0.05，0.1，0.2和0.4 mg/L等5种浓度的6-BA进行愈伤组织诱导。结果表明：在6-BA浓度为0.05 mg/L时，黑麦草各品种愈伤组织的诱导率最高；在相同浓度6-BA作用下，不同黑麦草品种间愈伤组织诱导率存在显著的品种间差异；不同基本培养基对黑麦草愈伤组织的诱导率也存在影响，4种供试基本培养基中，以CC基本培养基的黑麦草愈伤组织诱导率最高。

黑麦草；愈伤组织；6-BA

黑麦草(Lolium L.)属禾本科黑麦草属植物,原产于欧洲西南部、北非及亚洲西南部，栽培历史悠久。现已成为世界温带地区最重要的禾本科牧草[1]，具有生长快、分蘖多、耐牧、绿色期长和叶片光滑柔软、色泽美丽等优点[2]。在我国长江以北的温带地区，黑麦草是最重要的草种之一,对人工草地建植十分重要,是很有潜力的种质资源[3，4],在长江以南的亚热带和热带地区也经常与其它草种混播,广泛应用于公共绿地、家庭庭院、运动场和高尔夫球场的建设[3～7]。但因其越夏难、高温高湿条件下易发生病害、高温环境下需水量大等问题,限制了其在城市绿地和牧草种植中的应用。国内外多年来一直致力于通过组织培养及遗传转化技术对黑麦草进行遗传改良[8～10],并获得了转基因植株，但是还没有转基因抗高温节水型黑麦草品种应用于草业生产。对黑麦草进行遗传转化,第一步要建立其愈伤组织再生体系，而作为建立高频再生体系的前提和基础,愈伤组织的诱导非常关键[17，18]，高质量的愈伤组织是进一步诱导分化和生根的前提和基础[19]。

目前国内研究普遍认为以黑麦草成熟种子为外植体，在所用的愈伤诱导培养基中加入2，4-D(浓度为5 mg/L)诱导效果最佳,但诱导愈伤组织培养基中是否有必要加入分裂素(例如6-苄氨基嘌呤，6-BA)还不确定[11]。徐定炎等[12]通过实验表明，以6-BA浓度为0 mg/L时，黑麦草成熟种子愈伤组织诱导率最高；李雪等[13]通过实验认为，6-BA浓度对黑麦草成熟种子愈伤组织诱导率影响不显著；杜雪玲等[14]通过实验表明，在2,4-D为5 mg/L,6-BA为0.05 mg/L时,黑麦草各品种愈伤组织的质量和诱导率最高；陈季琴等[15]通过实验认为，2,4-D浓度在5 mg/L,6-BA浓度在0.025 mg/L或0.2 mg/L有利于黑麦草成熟种子诱导产生愈伤组织；杨茹等[16]通过实验认为，6-BA浓度为0.1 mg/L时有利于多年生黑麦草成熟种子诱导产生愈伤组织。因此，草坪草组织培养条件和植株再生频率的影响因素依然是一个亟待研究的重要课题[20]。本研究选取不同黑麦草成熟种子为外植体，研究不同浓度6-BA对黑麦草愈伤组织诱导的影响，并试图找到能产生高出愈率的黑麦草基因型(品种)、6-BA最佳浓度和最佳基本培养基，为黑麦草遗传转化打下基础，还有可能筛选耐高温节水型黑麦草无性变异系，为我国草业生产和黑麦草育种提供优良的种质资源。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验选用北京百绿(天津)国际草业有限公司提供的多年生黑麦草雅晴、沃土和一年生黑麦草特高等3个黑麦草品种的成熟种子作为外植体材料。

1.2 外植体消毒方法

先将3个黑麦草品种的种子用无菌水浸泡2 h，然后用70%酒精处理30 s,无菌水冲洗3次，再用升汞处理15 min，无菌水冲洗6次。经过处理的种子即可用于接种。

1.3 培养基

采用MS，N6，CC和NB等4种基本培养基，分别加5 mg/L的2，4-D，再分别加0，0.05，0.1，0.2和0.4 mg/L等5种浓度的6-BA，共设置了16种不同的培养基组合。调节各培养基的pH至5.8。

1.4 愈伤组织诱导

将经过消毒处理的3个黑麦草品种的种子接种到不同培养基组合,每个培养皿接种30粒种子,每个培养基组合设置3次重复,置于25～26℃、暗培养条件下进行愈伤组织诱导培养。

1.5 愈伤组织观察及记录

不同品种的黑麦草种子消毒后，分别接种于诱导愈伤组织的不同培养基组合中，接种7 d后开始统计种子的发芽率和出愈率，每隔5 d统计1次，记录数据。按如下公式和标准记录各处理的发芽率和出愈率：

发芽率(%)=发芽种子数/接种数×100

为解决加湿器启停带来的温湿度惯性，加湿器保持预热状态。当室内环境湿度需求变化时，根据PID控制算法，SCR可控硅加湿器无级调节输出精确的加热量。

出愈率(%)=愈伤组织不再变化后的愈伤组织块数/接种数×100

1.6 数据统计与分析方法

对各组培处理的发芽率、出愈率等数据，采用Excel统计分析软件分别进行统计分析和显著性测验。

2 结果与分析

2.1 不同6-BA浓度对黑麦草出愈率的影响

将经过消毒处理的3个黑麦草品种的种子接种到不同培养基组合,分别进行暗培养1周后，黑麦草种子开始发芽，最终发芽率的统计结果表明(表1)，不同浓度的6-BA对黑麦草的发芽率影响不明显，且黑麦草的发芽率对其愈伤组织出愈率影响也不明显。因此，黑麦草的发芽率与6-BA的浓度相关不明显，与其出愈率也无相关。

如表1所示，不同处理的黑麦草组织培养材料暗培养20 d后开始出现淡黄色的愈伤组织；40 d后统计不同处理组合的愈伤组织诱导率结果，不同浓度的6-BA处理，其黑麦草愈伤组织的诱导率不同。5种6-BA浓度处理中，0.05 mg/L的出愈率为42.1%,极显著高于其他浓度处理的出愈率；0 mg/L和0.1 mg/L处理的出愈率分别极显著高于0.2 mg/L和0.4 mg/L的处理。由此说明，在一定的浓度范围内，6-BA能够提高黑麦草愈伤组织的出愈率，但浓度过高反而会降低黑麦草组织培养的出愈率。

表1 不同6-BA浓度处理的黑麦草发芽率与出愈率

注：表中不同小写字母表示α=0.05水平上差异显著,不同大写字母表示α=0.01水平上差异极显著。下同。

2.2 黑麦草品种对愈伤组织诱导的影响

表2 不同品种的黑麦草发芽率与出愈率

从表2可知，不同黑麦草品种的发芽率差异不显著，以沃土发芽率最高，但其出愈率却最低，由此表明不同黑麦草品种的发芽率与其出愈率无关。不同黑麦草品种的愈伤组织诱导率不同，其中，特高的出愈率为34.9%，极显著高于其他两个黑麦草品种的出愈率；而雅晴与沃土的出愈率差异未达显著水平。

2.3 不同基本培养基对黑麦草愈伤组织诱导的影响

如表3所示，不同基本培养基的黑麦草种子暗培养1周后，种子开始发芽，不同基本培养基对黑麦草的发芽率影响不明显，并且，发芽率对不同基本培养基的黑麦草出愈率影响也不明显。结果表明，黑麦草的发芽率与基本培养基不存在明显的相关，与其出愈率也不相关。

不同基本培养基的黑麦草暗培养20 d后开始出现淡黄色的愈伤组织。40 d后对愈伤组织诱导率统计，结果表明：CC基本培养基的出愈率为42.2%,极显著高于其他3种基本培养基；N6基本培养基的出愈率最低，仅为15.5%。不同基本培养基的出愈率大小依次为CC>MS>NB>N6。由此可知，黑麦草愈伤组织诱导的最佳基本培养基是CC培养基。

表3 不同基本培养基的黑麦草发芽率与出愈率

3 讨 论

3.1 6-BA浓度对黑麦草愈伤组织诱导的影响

研究表明，黑麦草的愈伤诱导过程中，2,4-D浓度为5 mg/L时，在一定的范围内，加入不同浓度的6-BA，黑麦草的愈伤组织诱导率有所提高。如采用CC基本培养基，黑麦草品种特高在6-BA浓度为0 mg/L时，出愈率为51.1%，浓度为0.05 mg/L时，出愈率为67.8%，提高了16.7%。但随着6-BA浓度的继续增加，其出愈率反而明显下降。这与杜雪玲等人的研究结果一致[18]。但与其他人的结论有差别，可能与所用的黑麦草品种有关，还需做进一步的研究。

3.2 影响黑麦草愈伤组织诱导的因素

提高愈伤组织诱导率是建立植物组织培养再生体系的第一步,没有高频的诱导率,便无法得到大量的、高质量的愈伤组织,其随后的分化及生根便难以进行。

试验表明，在一定的6-BA浓度范围内，能够提高黑麦草愈伤组织的出愈率，这说明6-BA对愈伤组织诱导有促进作用。黑麦草愈伤组织诱导率存在显著的品种间差异，可能与品种遗传基因型差异有关。本研究结果表明，CC培养基为最适宜的基本培养基,可能是因为CC培养基中添加了0.2 mol/L浓度的甘露醇,这可使该培养基维持在一个较高的渗透压环境下，这种环境可能有利于黑麦草愈伤组织中内源细胞分裂素和脱落酸含量的提高,而这些激素含量的提高有利于促进黑麦草体细胞胚胎的形成。

3.3 最佳黑麦草愈伤组织诱导条件组合的选择

试验分析表明，不同6-BA浓度与不同黑麦草品种对黑麦草愈伤组织的出愈率均有极显著的影响，而6-BA浓度与不同黑麦草品种之间的互作不显著。通过多重比较，筛选出黑麦草愈伤组织诱导条件的最佳水平组合为：6-BA浓度为0.05 mg/L与黑麦草特高品种的组合。

试验分析表明，不同6-BA浓度与不同基本培养基对黑麦草愈伤组织出愈数均有极显著影响，而6-BA浓度与不同基本培养基之间的互作不显著。通过多重比较，筛选出黑麦草愈伤组织诱导条件的最佳水平组合为：6-BA浓度为0.05 mg/L与CC培养基的组合。

试验分析表明，不同黑麦草品种与不同基本培养基对黑麦草愈伤组织出愈数的差异未达显著水平，而且，黑麦草品种与基本培养基之间的互作也未达显著水平。通过多重比较，筛选出黑麦草愈伤组织诱导条件的最佳水平组合为：黑麦草品种特高与CC培养基的组合。

综上所述，通过不同6-BA浓度、不同黑麦草品种、不同培养基两两间的分析，最后筛选出黑麦草愈伤组织诱导的最佳组合为：0.05 mg/L的6-BA浓度+黑麦草品种特高+CC基本培养基。

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PreliminaryStudiesonEffectsof6-BAonCallusInductioninRyegrass

WULian-rong,XUQing-guo*,LIHong,WUYi-jun,HUANGPing,ZHANGTing,ZHAOXin,LIBin,GAOWei

(Department of Grassland Science, College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

The mature seeds of three different ryegrass cultivars, perennial ryegrass Yatsyn and Pandora, and annual ryegrass Tetragold, were selected as explants, four types medium of CC, MS, NB, N6 were used, 5 mg/L of 2, 4-D and different concentration of 6-BA were added to each medium to study the callus induction in order to establish the regeneration system of ryegrass. The results showed that the callus induction rate of 3 ryegrass cultivars was highest when the concentration of 6-BA was 0.05mg/L. Under the same concentration of 6-BA, the callus induction rate existed significant differences among different ryegrass varieties. There existed effect of different basic medium on ryegrass callus induction rate, and the ryegrass callus induction rate was highest in CC treatment.

Ryegrass; Callus; 6-BA

吴莲蓉(1990-)，女，湖南邵阳人。*通讯作者，Email：huxu0309@yahoo.com.cn。

湖南农业大学大学生研究性学习和创新性实验计划项目；中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室开放课题(Y052811t04)；湖南省科技厅项目(2010NK3014与10077)。

S543+.601

A

1001-5280(2012)01--03

10.3969/j.issn.1001-5280.2012.01.