双重抗性筛选辅酶Q10高产菌株

尹 鹏，魏宝东

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866）

双重抗性筛选辅酶Q10高产菌株

尹 鹏，魏宝东*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳110866）

以米曲霉（Aspergillus oryzae）Asp11为出发菌株，利用紫外线诱变处理，以制霉菌素和维生素K3双抗性为筛选标记，获得制霉菌素抗性突变株Asp11-N006和制霉菌素及维生素K3双重抗性突变株Asp11-N006-V01，其合成辅酶Q10的能力较出发菌株显著提高。Asp11-N006和Asp11-N006-V01的辅酶Q10产量分别为28.27mg/L和38.46mg/L，较出发菌株分别提高了0.34倍和0.82倍，且遗传性状稳定。

米曲霉，辅酶Q10，诱变，抗性筛选

辅酶Q10是生物体内广泛存在的脂溶性醌类化合物，又称泛醌、癸烯醌，它是呼吸链中NADH脱氢酶、Ain酸脱氢酶和维生素B-C复合物之间的脂溶性电子载体，是细胞能量代谢的生成要素[1-2]。作为与能量转换有关的若干酶系统的辅助因子之一，它不仅是呼吸链上的氧化还原成分，更是生成ATP的必需辅酶[3]。辅酶Q10可与线粒体内膜相结合，在呼吸链中起载体作用；另外，因其醌式及侧链异戊烯基结构等特点，还是重要递氢体和细胞能量生成要素，并具有抗氧化和控制细胞内氧气流动等性能，在生命体中发挥着重要的生理功能[4]。它不仅是细胞自身天然的抗氧化剂、细胞代谢的促进剂和呼吸的激活剂，对清除自由基及稳定生物膜功能有着重要作用，还具有增强人体免疫功能、预防心脏病、保护肝脏和抗癌等作用[5]。因此，辅酶Q10在用于临床治疗疾病、提高免疫力和延缓人体衰老等方面有着不可代替的作用[6]。利用微生物发酵生产辅酶Q10是最具发展前途的生产方式。但是，有很多因素制约着发酵法工业化生产，而导致产量相对较低。其中，高产菌株的选育是目前发酵法生产辅酶Q10的研究关键。本实验从筛选辅酶Q10高产菌株出发，以米曲霉为出发菌株，定向筛选得到抗性突变株，以期能有所突破，提高辅酶Q10产量。米曲霉作为发酵生产辅酶Q10的新菌种，在国内外尚未见到相关报道。因此，通过本研究，以期为工业化生产辅酶Q10提供新的实践基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

米曲霉（Aspergillus oryzae） 本院实验室保存；斜面培养基 PDA培养基（新鲜马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1000mL，pH自然）；发酵培养基（%） 葡萄糖2.5、蔗糖2.5、蛋白胨1、酵母浸粉2、KH2PO40.1、K2HPO40.05、MgSO40.05，pH6.5；抗性培养基 采用PDA培养基，分别加入一定量的制霉菌素和维生素K3；辅酶Q10标准品 北京夏斯生物技术有限公司；制霉菌素、维生素K3美国Genview；其他试剂 均为分析纯和生化试剂。

PB-10 pH计 Sartorius Co.Ltd；恒温振荡培养箱 北京沃德电子实验设备厂；CT14RD台式高速冷冻离心机 上海天美科学仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 孢子悬液的制备 取一支新鲜培养至孢子成熟的出发菌株试管斜面，加入5mL去离子水，轻轻振荡试管，洗下斜面上的孢子，转移至装有10mL无菌水的三角瓶（内含玻璃珠）中，再加入5mL去离子水冲洗斜面，并一同转入三角瓶，然后摇床振荡30min以充分打散孢子团，最后通过血球计数板计数，调整孢子悬液的浓度为107个/mL。

1.2.2 制霉菌素和维生素K3最小抑制浓度的确定 在PDA培养基中分别添加质量浓度为70、80、90、100、110、120、130、140μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，取0.2mL出发菌株制备的孢子悬液涂布于该抗性平板上，同时以未加制霉菌素的平板作为对照，30℃培养3～4d后观察菌落的生长状况。

在PDA培养基中分别添加质量浓度为120、130、140、150、160、170μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，将诱变得到的抗性菌株Asp11－N006制备孢子悬液，取0.2mL涂布于该抗性平板上，确定最小抑制浓度。在确定该浓度之后，在PDA培养基中添加该浓度的制霉菌素，同时添加质量浓度为320、340、360、380、400、420、440、460μg/mL的维生素K3制成抗性平板，取0.2mL抗性菌株Asp11－N006制备的孢子悬液涂布于该平板，同时以未加维生素K3的平板作为对照，30℃培养3～4d后观察菌落的生长状况。

1.2.3 紫外诱变 将20W的紫外灯开启预热20min，取5mL制备的孢子悬液于9cm的无菌培养皿中，置于紫外灯下垂直距离30cm处边磁力搅拌边照射，照射时间为5min，然后在红灯下吸取1mL紫外照射的孢子悬液适当稀释，涂布平板进行抗性筛选，同时以未经照射的空白组为平行对照。

1.2.4 平板初筛 将诱变后的孢子悬液适当稀释涂布于抗性平板上，30℃培养3～4d，挑取菌落生长快、孢子数量多的单菌落转接入斜面培养基，30℃培养后冷藏保藏，以备进一步摇瓶复筛。

1.2.5 摇瓶复筛 将初筛得到的抗性菌株按1.2.1的方法制备孢子悬液，调整浓度为109个/mL，然后按12%的接种量，直接将孢子悬液接到发酵培养基中，30℃、180r/min恒温振荡培养72h。离心收集菌体，测定辅酶Q10产量。

1.2.6 产物分离测定 利用碱醇皂化法[7]从菌体中提取辅酶Q10。采用薄层层析（TLC）分离浓缩发酵液中的辅酶Q10，并用紫外分光光度法[8]测定发酵液中辅酶Q10的产量。

2 结果与分析

2.1 米曲霉产辅酶Q10的确定

米曲霉为好氧型真菌，是重要且安全的工业发酵菌株[9]。将米曲霉作为出发菌株发酵培养后，对其菌体的萃取液进行浓缩，并定容于1mL无水乙醇中进行薄层层析分离，结果见图1。

由图1可以看出，出发菌株粗提品经TLC（薄层层析）分离，在与辅酶Q10标准品色带相同的Rf值处，也分离出了色带，刮下标准品色带和出发菌株粗提品色带，分别定容于3mL无水乙醇中，在190～330nm波长范围内进行紫外扫描，结果见图2。

由图2可以看出，出发菌株粗提品的紫外吸收峰型和辅酶Q10标准品的吸收峰型相一致，这说明米曲霉能合成辅酶Q10，其出发菌株的产量为21.09mg/L。

图1 辅酶Q10标准品与出发菌株粗提品的薄层层析图Fig.1 Thin－layer chromatogram of coenzyme Q10standard and the starting strains crude products

图2 出发菌株粗提品的紫外吸收光谱Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of starting strain crude products

2.2 制霉菌素抗性突变株的筛选

在PDA培养基中分别添加质量浓度为70、80、90、100、110、120、130、140μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，取出发菌株制备的孢子悬液涂布于该抗性平板上，同时以未加制霉菌素的平板作为对照，30℃培养3～4d后观察菌落的生长情况，见表1。

表1 制霉菌素对菌体生长的影响Table 1 Effect of nystatin on cell growth

通过表1可以确定制霉菌素的最小抑制浓度为130μg/mL，并以此浓度作为抗性筛选标记。出发菌株Asp11的孢子悬液经紫外诱变处理，适当稀释后涂布于含制霉菌素浓度130μg/mL的抗性平板上，30℃培养3～4d，挑取生长良好的单菌落转接于PDA斜面。再经摇瓶复筛，得到8株产量高于出发菌株25%的制霉菌素抗性菌株，见表2。其中，抗性菌株Asp11－N006的产量提高幅度最大，辅酶Q10产量为28.27mg/L，较出发菌株提高了0.34倍。再对该抗性菌株连续传代十次，进行遗传稳定性实验。结果显示，随着传代次数的增加，各代菌株辅酶Q10产量从28.27mg/L到27.06mg/L，产量无明显减少，说明该突变株的性状能稳定遗传。

表2 抗性菌株的辅酶Q10产量Table 2 The production of coenzyme Q10from resistant strains

结果表明，选育制霉菌素抗性突变株，可以在一定程度上提高辅酶Q10产量。推测原因，制霉菌素作为一种大环内酯类真菌抑制剂，能和真菌细胞膜中的麦角固醇结合，引起细胞膜损伤，从而使细胞膜的通透性增加。可能由于制霉菌素抗性突变株的细胞膜通透性发生改变，从而增加了菌体对营养物质的吸收，有利于进一步合成辅酶Q10。

2.3 制霉菌素及维生素K3双重抗性突变株的筛选

在PDA培养基中分别添加质量浓度为120、130、140、150、160、170μg/mL的制霉菌素，制成抗性平板，取上述诱变得到的抗性菌株Asp11－N006制备的孢子悬液涂布于该抗性平板上，同时以未加制霉菌素的平板作为对照，30℃培养3～4d后观察菌落的生长状况，确定制霉菌素的最小抑制浓度，见表3。

在确定该浓度之后，在PDA培养基中添加该浓度的制霉菌素，同时添加质量浓度为320、340、360、380、400、420、440、460μg/mL的维生素K3制成双重抗性平板，取抗性菌株Asp11－N006制备的孢子悬液涂布于该平板，同时以未加维生素K3的平板作为对照，30℃培养3～4d后观察菌落的生长状况，见表3。

表3 维生素K3对菌体生长的影响Table 3 Effect of Vitamin K3on strain growth

通过表3可以确定制霉菌素的最小抑制浓度为150μg/mL、维生素K3的最小抑制浓度为420μg/mL，并以此浓度作为抗性筛选标记。将抗性菌株Asp11－ N006的孢子悬液进行紫外诱变处理，适当稀释后涂布于含制霉菌素浓度150μg/mL和维生素K3浓度420μg/mL的抗性平板上，30℃培养3～4d，挑取生长良好、孢子数量多的单菌落转接于PDA斜面。再经摇瓶复筛，得到5株产量高于出发菌株50%的制霉菌素及维生素K3双重抗性菌株，其中，抗性菌株Asp11－N006－V01的产量提高幅度最大，辅酶Q10产量为38.46mg/L，较抗性菌株Asp11－N006提高了0.36倍，较出发菌株提高了0.82倍。再对该抗性菌株连续传代十次，进行遗传稳定性实验。结果显示，随着传代次数的增加，各代菌株辅酶Q10产量从38.46mg/L到37.23mg/L，产量无明显减少，说明该突变株的性状能稳定遗传。

结果表明，以制霉菌素抗性突变株为出发菌株，进一步筛选得到制霉菌素及维生素K3双重抗性突变株，有利于进一步提高辅酶Q10产量。在辅酶Q10合成过程中可能存在终产物抑制，筛选抗结构类似物突变株可从遗传角度解除微生物的正常代谢调控，有利于目的产物的合成。维生素K3是辅酶Q10的结构类似物，筛选出的突变株对维生素K3的耐受浓度提高，可能部分解除了终产物对参与辅酶Q10生物合成的有关酶的反馈抑制，从而提高了辅酶Q10的生物合成量。

2.4 抗性菌株产辅酶Q10的分离测定

图3 辅酶Q10标准品与抗性菌株粗提品的薄层层析图Fig.3 Thin－layer chromatogram of coenzyme Q10standard and resistant strains crude products

图4 抗性菌株粗体品的紫外吸收光谱Fig.4 Ultraviolet absorption spectra of resistant strain crude products

将上述筛选得到的抗性菌株Asp11－N006和Asp11－N006－V01进行发酵培养，发酵结束后离心收集菌体，采用碱醇皂化法提取菌体中的辅酶Q10，将所得粗提品定容至1mL无水乙醇中，进行薄层层析分离（见图3），定性测定辅酶Q10产量，并用紫外分光光度法定量测定发酵液中辅酶Q10的产量，结果见图4和表4。

表4 抗性菌株的辅酶Q10产量Table 4 The production of coenzyme Q10from resistant strains

3 结论

3.1 米曲霉为好氧型微生物，通过TLC（薄层层析分离）说明，在其生长代谢过程中能够合成辅酶Q10。

3.2 本实验选取了两个抗性筛选标记，通过紫外诱变选育到制霉菌素抗性突变株Asp11-N006和制霉菌素及维生素K3双重抗性突变株Asp11-N006-V01，对该菌株进行发酵培养，其辅酶Q10产量分别为28.27mg/L和38.46mg/L。相较出发菌株而言，产辅酶Q10能力分别提高了0.34倍和0.82倍，为实现工业化生产奠定了一定的基础。

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Screening coenzyme Q10high-yielding strain with double resistance screening label

YIN Peng，WEI Bao-dong*
（College of Food Science，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Aspergillus oryzae（Asp11）was used as the starting strain，through UV mutagenesis，obtained resistant mutants Asp11-N006 and Asp11-N006-V01 with double resistance of Nystatin and vitamin K3as screening label，and production of coenzyme Q10performance marked higher than the starting strain.The production of coenzyme Q10reached to 28.27mg/L and 38.46mg/L，improved into 0.34 times and 0.82 times by comparing with the starting strain.The mutant strains had stable genetic traits.

Aspergillus oryzae；coenzyme Q10；mutagenesis；resistance screening

TS201.3

A

1002-0306（2012）07-0150-04

2011－06－01 *通讯联系人

尹鹏（1985-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学。