人胎羊膜在促进切口愈合过程中的作用机制

罗秋燕 申素芳 (新乡医学院第三附属医院妇产科，河南 新乡 453003)

胎盘作为一种传统中药具有温肾补精、益气养血的功效〔1〕。羊膜外敷创面具有透水、透气及良好的创面黏合力，可以减少创面感染，减轻疼痛，使创面保持一定的湿度，为上皮细胞生长提供一个良好的环境，加速创面的愈合，现已广泛应用于烧伤、眼科。现代医学研究表明，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是锌和钙依赖性内肽酶，具有很强的生物学作用，可降解细胞外基质(ECM)中的许多蛋白，在组织修复、血管形成及组织形态发育、创伤愈合过程中扮演重要角色〔2〕。本研究旨在探讨羊膜外敷对大鼠皮肤切创愈合过程中创缘周围MMP-2表达的影响，进一步阐述其促进伤口愈合的机制，为其临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源 新鲜羊膜均来自我院妇产科健康剖宫产产妇的胎盘，产前血清学检查排除艾滋病、乙肝、丙肝、梅毒等传染性疾病，无污染且羊水澄清的胎盘，将钝性分离后获得的羊膜层放入1‰洗必泰溶液中浸泡消毒10 h后，放入无菌密闭容器内，保存于4℃冰箱〔3〕。将60只体重300～400 g的健康成年清洁级SD雄性大鼠(由新乡医学院实验动物中心提供)随机分成两组，每组30只。其中1组为对照组，另1组为羊膜组。每组各设伤后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d 六个时相点，每个时相点5只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠皮肤切创模型的建立 10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉后，背部正中用8%硫化钠备皮。局部用碘伏、酒精消毒，用无菌手术刀在背部沿脊柱旁约1 cm处做长约4 cm的纵行切口，深达肌层，创面自然止血后间断缝合皮肤及皮下组织，对照组用无菌纱布覆盖切口并包扎，羊膜组将处理过的羊膜直接贴敷在切口表面，纱布覆盖并包扎。将处理后的大鼠分笼饲养，3 d后换药，不换羊膜，并于切创后12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d分别将两组大鼠脱颈椎处死。取创口处及周围1.0 cm×1.5 cm全层皮肤及皮下组织，取材后均放入4%多聚甲醛中固定6 h，脱水、透明、石蜡包埋〔4〕。

1.2.2 免疫组化染色 制作5 μm厚石蜡切片，贴敷于涂有多聚赖氨酸(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)的载玻片上。水浴修复抗原(抗原修复液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供)，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗5 min，共3次。正常羊血清孵育。兔抗鼠单克隆抗体MMP-2作为一抗(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)。生物素-亲合素-过氧化物酶复合物(S-P)法免疫组织化学染色(北京博奥森生物技术有限公司提供)、二氨基联苯胺(DAB)显色(北京中杉金桥生物技术有限公司提供)均按说明书进行。苏木素复染，PBS代替一抗作为阴性对照。未见非特异性染色，另做常规苏木素-伊红(HE)染色。显微镜下按着色深浅及范围分为：不着色为阴性;部分胞质着淡黄色为弱阳性;胞质或胞膜大部分着黄色为阳性;胞质或胞膜着浅褐黄色为中等阳性;胞质或胞膜着深褐黄色为强阳性等5个等级〔5〕。在光学显微镜(40×10)下每张切片随机取5个测量视野，计数包括中性粒细胞、单核细胞及血管内皮细胞，计算每个视野中阳性细胞数与三种细胞总数的比值。

1.3 切口感染评定 参照文献〔6〕标准判断，甲级：切口愈合优良，无不良反应;乙级：愈合处有炎症反应，如红肿、硬结、血肿，积液多，但未化脓;丙级：切口化脓。乙级、丙级愈合被定性为切口感染。

1.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料以s表示，计数资料比较采用χ2检验;不同时间点两两比较采用t检验。

2 结果

2.1 两组各时间点MMP-2的表达 伤后12 h，羊膜组和对照组均可见MMP-2在大部分中性粒细胞中表达。随后1 d两者表达开始逐渐增强，以中性粒细胞为主，可见散在单核细胞表达，部分血管内皮细胞也有呈阳性表达。3 d达到高峰，阳性细胞以中性粒细胞为主，部分血管内皮细胞及成纤维细胞也呈阳性表达。5 d后在炎性细胞中表达显著减少，以成纤维细胞为主，呈逐渐下降趋势。7 d伤口已基本愈合，MMP-2仍有少量表达。两组在不同损伤时相的表达趋势基本相同，不同的是创伤12 h、1 d、2 d、3 d 后羊膜组较对照组表达增强，伤后 5 d、7 d 羊膜组与对照组表达无明显差别。见表1。

表1 各时段MMP-2阳性细胞比例(s)

表1 各时段MMP-2阳性细胞比例(s)

损伤时间 对照组 羊膜组 P值12 h 35.39±1.02 37.11±1.16 ＜0.05 1 d 43.61±1.36 45.54±1.49 ＜0.05 2 d 54.24±1.72 56.86±2.16 ＜0.05 3 d 62.03±2.43 69.69±2.69 ＜0.01 5 d 45.03±1.81 46.66±1.58 ＞0.05 7 d 23.83±1.53 25.00±1.04 ＞0.05

2.2 两组切口感染率的比较 对照组30只大鼠中出现切口感染10只，感染率为33.3%;羊膜组中切口感染2只，感染率为6.7%，两组比较具有统计学差异(P＜0.05)。

3 讨论

损伤后12 h～3 d，炎症细胞表达MMP-2的意义可能在于促进损伤局部中性粒细胞迁移，参与炎症反应。本实验结果提示羊膜的生长因子可能诱导激活炎性修复细胞分泌MMP-2使其表达增高，进一步促使炎性细胞向伤口处转移，加速组织清创，对创面的修复起着关键作用。

本实验研究表明，伤后5～10 d持续稳定高水平表达MMP-2，也进一步说明了损伤愈合晚期，高水平表达的MMP-2能进一步增加胶原的合成和沉积;另外，有研究表明MMP-2的表达可以促进MMP-9的表达与活化。这充分表明了愈合创口中以及创口周围MMP-2的持续不同水平的表达对血管生成、胶原沉积并增加创口张力均有重要的作用。

胎盘即中药紫河车，为中医学补益要药。人羊膜系胎盘的一部分(羊膜的胎儿面)，是一种天然高分子生物材料，具有益气养血之功效，因可以改善气血不足状态，有助于促进伤口收敛。现代药理研究表明，其内含的糖类和氨基酸能提高机体局部产热机能，加强局部血液供应，改善微循环，从而补充组织细胞所需的营养〔7〕，提高抗过敏能力，直接促进组织细胞的修复与再生长。同时，免疫反应极低。羊膜含有生物源性刺激素，可促进肉芽组织及上皮生长，加速创面的愈合且瘢痕不明显。

总之，羊膜类生物敷料来源广泛，取材方便，易制备，无毒副反应，疗效满意，安全无痛苦，易被患者接受，不受条件、气候限制，是促进创面愈合较为理想的生物敷料。

1 文 亮，屈纪富，刘明华.基质金属蛋白酶3在创伤愈合中作用的实验研究〔J〕.世界急危重病医学杂志，2007;2：1751-4.

2 刘文忠，恩和吉日嘎拉，康毅敏，等.皮肤创面组织VEGF和MMP-2的表达及意义〔J〕.内蒙古医学院学报，2009;31：85-7.

3 O'Toole EA.Extracellular matrix and keratinocyte migration〔J〕.Clin Exp Dermatol，2001;26：525-30.

4 Deprest J，Jani J，Lewi L，et al.Fetoscopic surgery：encouraged by clinical experience and boosted by instrument innovation〔J〕.Semin Fetal Neonatal Med，2006;11(6)：398-412.

5 Bilic G，Hall H，Bittermann AG，et al.Human preterm amnion cells cultured in 3-dimensional collagen I and fibrin matrices for tissue engineering purposes〔J〕.Am J Obstet Gynecol，2005;193(5)：1724-32.

6 Papadopulos NA，Klotz S，Raith A，et al.Amnion cells engineering：a new perspective in fetal membrane healing after intrauterine surgery〔J〕?Fetal Diagn Ther，2006;21(6)：494-500.

7 朱志军，徐国士，赵 静，等.牛羊膜在烧伤创面的临床应用研究〔J〕. 中国修复重建外科杂志，2006;20(7)：735-8.