低温冷藏对东方蜜蜂行为活动反应的影响

刘 柳 赵海洲 董 坤 王文思 段晓林 和绍禹

（云南省蜜蜂资源可持续利用工程研究中心，云南农业大学东方蜜蜂研究所，云南农业大学食品科学技术学院，昆明 650201）

蜜蜂属于变温动物，其体温随环境气温变化而变化，单只蜜蜂的体温正如所有单独生活的昆虫一样，在很大程度上取决于周围的气温[1-3]。尤其在冬天或早春，虽然天气晴朗，太阳光线刺激蜜蜂出巢，但早晨的气温仍然较低，蜜蜂容易受到低温冷害的影响[4-5]。低温冷害在不同程度上直接或间接影响蜜蜂的生命活动，因而会使其产生相应的生理反应[6]。在低温条件下蜜蜂将停止飞翔，翅肌呈现僵硬，随着时间延长蜜蜂会陷入冻僵昏迷状态，在短时间内，如果温度及时升高，蜜蜂仍可恢复活力，但如果低温时间太长，则有致死的危险[1,6]。

目前，有关蜂群内温度的变化与调控及其对蜂病的影响或温度对蜂卵、幼虫、蜂盖子及成虫各发育阶段的影响有很多报道[7-13]，而西方蜜蜂在低温条件下的行为活动反应已有相关报道[14-15]，但不同蜂种的个体对气温的行为反应有所差异，目前东方蜜蜂对低温的行为反应尚未见报道[7-16]。本研究拟利用恒温箱观察东方蜜蜂在0℃～10℃低温区内的行为活动反应，尤其是足、触角、翅、吻及腹部等器官和部位在冻僵过程和复苏过程中行为活动变化，低温冷藏条件对蜜蜂冻僵率和恢复正常率的影响，以期为东方蜜蜂活体标记技术提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

本研究于2011年7月～2011年9月在云南农业大学东方蜜蜂研究所的实验室进行。

1.2 试验材料

1.2.1 供试蜂种

实验蜂种为云南农业大学东方蜜蜂研究所提供的中华蜜蜂，共1群，群势4～5脾。

1.2.2 仪器设备

本研究室内使用仪器包括：恒温箱（温度范围0℃～50℃，波动范围≤±0.5℃）、玻璃试管（直径为30mm）、计时器、室内温度计、室外温度计、蜂帽等。

1.3 试验方法

利用恒温箱提供实验所需的低温环境（0℃～10℃），冷藏温度分别设为0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃，每个温度下的冷藏时间均设为3 min、5 min、7 min、9 min、11 min、13 min、15 min、17 min，而每个温度下的最长冷藏时间因冷藏效果而异，直至每个温度下冷藏的所有蜜蜂完全冻僵。试验中，5只东方蜜蜂作为一组，盛放在带有棉塞的玻璃试管内并置于恒温箱中，每个温度下不同冷藏时间重复2次。在相应的冷藏温度和冷藏时间下观察并记录蜜蜂个体行为活动的变化，尤其吻、触角、翅肌、腹部、足等器官或部位的行为活动变化情况以及冻僵的比例，当冷藏时间结束时，将盛有蜜蜂的试管从恒温箱中取出并置于木板上，在室温条件下观察20 min，描述冷藏状态的蜜蜂恢复过程，尤其吻、触角、翅肌、腹部、足等器官或部位的行为活动变化，并记录每只蜜蜂恢复至振翅飞行所需时间及恢复正常蜜蜂所占比例。

某一冷藏温度和冷藏时间下的蜜蜂完全冻僵率计算公式如下：

完全冻僵率=处于完全冻僵状态的蜜蜂数量/供试蜜蜂数量

某一冷藏温度下经过一定的冷藏时间后，室温下蜜蜂恢复正常率计算公式如下：

恢复正常率=不同冻僵状态下的蜜蜂恢复至正常状态数量/供试蜜蜂数量

2 结果与分析

2.1 东方蜜蜂完全冻僵过程及其行为活动变化

试验中，将盛有5只东方蜜蜂且带有棉塞的玻璃试管置于恒温箱中，随着冷藏时间的延长，试管中活动正常的蜜蜂个体逐渐呈僵迟状态，随着冷藏时间的继续延长，活动僵迟的蜜蜂个体逐渐陷入昏迷状态直至躯体完全冻僵侧倒于玻璃试管内壁。从东方蜜蜂行为活动变化看，其完全冻僵过程大致可分为轻度冻僵、中度冻僵、重度冻僵和完全冻僵四个阶段。

2.1.1 轻度冻僵

随着冷藏时间的延长，试管中积极正常的蜜蜂个体逐渐陷入僵迟状态，爬行迟缓，不振翅，腹部抖动（节律性的振动）频率明显减慢，此时触角的柄节、梗节至鞭节呈180°打直状态，且两触角的柄节间的夹角呈钝角，伸向两侧，其整个触角的灵动性明显降低。

2.1.2 中度冻僵

在恒温箱中继续冷藏，蜜蜂陷入中度冻僵过程，不爬行，足部各节收拢；不振翅，两翅趋于合拢，微张并覆于蜜蜂的背部；腹部抖动频率较低且向腹面微弯；两触角的柄节间夹角由钝角逐渐缩小，其灵动性较低且鞭节向柄节收拢。

2.1.3 重度冻僵

随着冷藏时间的延长，蜜蜂陷入昏迷状态侧倒于试管壁，三对足各节紧缩，偶尔抖动；两翅合拢叠搭，覆于蜜蜂的腹部背面，不振翅；腹部紧缩，更弯向腹面，偶尔抖动；触角鞭节继续折向柄节，趋于合拢，两触角的柄节间夹角逐渐缩小至锐角状，由两侧伸向中间，基本不动。

2.1.4 完全冻僵

一段时间后，试管中的蜜蜂完全冻僵，伸吻，每对足相互紧抱，各器官或部位完全停止运动，侧倒于试管壁，整个身体紧缩，呈C型弯曲；触角鞭节折向柄节，接近合拢但并未完全合拢，两触角柄节移向额部中间趋于合拢，两个触角完全不动。

2.2 完全冻僵的东方蜜蜂复苏过程及其行为活动变化

将盛有5只完全冻僵的东方蜜蜂且带有棉塞的玻璃试管从恒温箱中取出并将试管内的蜜蜂倒置于木板上，随着时间的延长，冻僵的蜜蜂的吻、触角、翅肌、腹部、足等器官或部位的行为活动逐渐复苏萌动，随着复苏时间的继续延长，蜜蜂完全苏醒直至恢复积极状态，能振翅飞行。根据蜜蜂行为活动变化，完全冻僵的东方蜜蜂复苏过程可分为复苏萌动、完全苏醒、积极状态三个阶段。

2.2.1 复苏萌动

完全冻僵的蜜蜂，处于昏厥状态，在室温下很快开始复苏，其腹部抖动频率逐渐增大，触角极其缓慢的做小幅抖动，其鞭节处缓慢地远离柄节处，柄节、梗节、鞭节呈180°打直状态，三对足逐渐的向腹部两侧伸展，合拢的双翅逐渐向身体两侧伸展，此时其头部和腹部相对，整只蜜蜂呈蜷缩状，伸出的吻逐渐缩回，蜷缩的身体逐渐伸展开来，其足又逐渐的向腹部两侧伸展，准备翻身直立。

2.2.2 完全苏醒

蜜蜂倾斜的身体逐渐翻身呈直立状态，三对足无力地支撑整个身体的重量，趴在木板上，后又逐渐恢复体力，三对足伫立在原地，不爬行，双翅合拢，亦不振翅，触角呈打直状态，两个触角柄节间的夹角逐渐恢复至正常状态的钝角形，运动灵活且抖动频数逐渐增加，腹部不断的抖动。

2.2.3 积极状态

完全苏醒的蜜蜂逐渐恢复至积极状态，十分活跃，触角极其灵动，腹部恢复到正常状态下节律性的振动，爬行十分灵活，即时振翅飞行。

2.3 冷藏条件对东方蜜蜂冻僵效果和恢复效果的影响

2.3.1 冷藏条件对蜜蜂完全冻僵率和恢复正常率的影响

本试验选择0℃、2℃、4℃、6℃、8℃、10℃ 6种温度冷藏蜜蜂，冷藏后的蜜蜂室温下进行复苏。由图1可知，当冷藏温度一定时，随着冷藏时间的延长，完全冻僵的蜜蜂比例逐渐增加，而冷藏后室温下能恢复正常的蜜蜂比例逐渐降低；但10℃冷藏3～17 min，所有蜜蜂均未出现完全冻僵现象，10℃冷藏时间超过13 min后，冷藏后的蜜蜂有一部份不能再恢复正常而死亡；当冷藏时间一定时，冷藏的温度越低，蜜蜂完全冻僵比例越高，同时蜜蜂完全冻僵状态出现的越早，而冷藏后室温下蜜蜂复苏的过程恰好相反，当冷藏时间一定时，冷藏的温度越高，恢复正常的蜜蜂比例也越高，同时蜜蜂恢复正常所需的时间较短。0℃、2℃下冷藏蜜蜂，冷藏时间超过15 min后，蜜蜂完全冻僵率达到100%。而当冷藏时间达到15 min时，0℃、2℃下冷藏的蜜蜂，约有一半个体室温下不能恢复正常，不久后死亡。事实上从图中可以看出，在6种冷藏温度下，当冷藏时间短于7 min时，室温下蜜蜂恢复正常的比例为100%，9～13 min时，蜜蜂恢复正常的比例开始出现下降，当达到17 min时，蜜蜂恢复正常的比例为50%左右。综合考虑蜜蜂完全冻僵率和恢复正常率，在0℃、2℃下冷藏11～13 min时，蜜蜂完全冻僵率和冻僵后室温下恢复正常率均最高，可作为东方蜜蜂活体标记技术的最佳冷藏条件。

2.3.2 冷藏条件对蜜蜂恢复至振翅飞行所需时间的影响

从表1可以看出，冷藏温度和冷藏时间对室温条件下蜜蜂恢复至振翅飞行所需的时间有较大影响。总体上当冷藏时间一定时，冷藏温度愈高，蜜蜂恢复至振翅飞行所需时间愈短；而当冷藏温度一定时，随着冷藏时间的增加，蜜蜂恢复至振翅飞行所需时间愈长。结合图1，当蜜蜂完全冻僵率和冻僵后室温下恢复正常率均较高时，也就是在0℃下冷藏11 min或13 min时，蜜蜂完全冻僵率分别为70%和80%，室温下恢复正常率均为60%，而蜜蜂恢复至振翅飞行所需时间分别为423 s（约7.1 min）和462 s（约7.7 min）。在2℃下冷藏11 min或13 min时，蜜蜂完全冻僵率分别为60%和70%，室温下恢复正常率分别为70%和60%，而蜜蜂恢复至振翅飞行所需时间分别为242 s（约4.0 min）和245 s（约4.1 min）。

表1 蜜蜂恢复至振翅飞行所需时间（s）

3 讨论

单只蜜蜂的体温在很大程度上取决于周围的气温,且不同蜂种个体对气温的反应有所差异[3]。如中蜂个体临界安全温度为10℃ ，意蜂的临界安全温度为13℃ ，意蜂个体在13℃ 以下呈现僵硬，蜜蜂逐渐停止飞翔，而中蜂在10～11℃ 时，可以外出飞行[4]。而西方蜜蜂对低温的反应，气温在7～9℃下，单个蜜蜂陷入轻度冻僵；在4～5℃，开始完全冻僵；在2～5℃ ，15～20 min后完全冻僵[6]。本试验在0～10℃ 范围内将蜜蜂置于恒温箱内，研究了东方蜜蜂对低温的反应，发现在0～10℃ 范围内随着冷藏时间的延长，蜜蜂都会经历轻度冻僵直至身体完全冻僵的过程，蜜蜂对低温的抗寒能力受温度和冷藏时间两方面的共同影响，温度越低冷藏时间越长，蜜蜂的完全冻僵率越高，而温度越高冷藏时间越短，蜜蜂的完全冻僵率越低，在所设定的6种温度下冷藏3～5 min，均未出现完全冻僵的个体。但总体看来，东方蜜蜂在0～4℃, 5～7 min开始动作迟钝，轻度冻僵，7～11 min开始出现完全冻僵的现象；6～8℃，5～7 min开始动作迟钝，轻度冻僵，13～17 min开始出现完全冻僵现象；冷藏温度在10℃时，7～9 min开始动作迟钝，轻度冻僵，21 min后开始出现完全冻僵的现象。

试验中，不同的蜜蜂个体对低温的抵抗能力存在一定差异，在相同的冷藏条件下，一些个体冻僵的速度较慢，而复苏过程中恢复至正常状态所需的时间较短。我们推测除了遗传变异的因素外，这种现象可能由于采集蜂的日龄及蜜囊内的储蜜量的差异造成的。

目前，用于快速准确标记活体蜜蜂的方法甚是有限，现使用的有CO2熏晕法和低温冷藏冻僵法[1]。但是用CO2熏晕法进行活体蜜蜂标记仍存在一定的问题：1）CO2的试验成本高；2）使用CO2熏晕蜜蜂时，其使用量难以得到相应的控制，倘若CO2使用过量，就会导致实验蜂死亡，且使用CO2熏晕的蜜蜂复苏的迅速，难以达到快速准确标记活体蜜蜂的目的。低温冷藏冻僵法现已应用于西方蜜蜂活体标记以开展相关试验，而在东方蜜蜂活体标记应用较少[16]。本试验通过对东方蜜蜂在低温区的行为反应研究，发现不同冷藏条件不仅影响到蜜蜂冻僵比例同时也会影响到冻藏后的蜜蜂恢复正常的比例。因此，本试验的结果为东方蜜蜂活体标记提供了理论依据。

根据本试验的观察，低温对蜜蜂吻、触角、翅、腹部、足等器官和部位的行为活动会产生不同程度的影响。虽然这些器官和部位随着冷藏时间的延长都会从正常活动状态进入迟缓状态直至完全停止活动，但其完全冻僵出现的时间并不一致，其先后顺序依次为：足、翅、腹部、触角、吻，就足而言，其冻僵的顺序为前足、中足、后足。完全冻僵的蜜蜂在室温下复苏时腹部、触角、后足、中足、前足、翅、吻等器官和部位依次恢复活动功能直至身体完全恢复到正常的积极状态而振翅起飞。因此我们推断，吻、触角、翅、腹部、足等器官和部位对低温的抵抗能力存在着一定的差异。蜜蜂的试验中观察到，东方蜜蜂在复苏过程中经常会出现2-3只蜜蜂交流的现象。当2只蜜蜂交流时，首先一只蜜蜂表现为主动伸吻，而另一只蜜蜂则表现为被动伸吻，2只蜜蜂的吻频繁接触，同时触角相互快速频繁触碰，然后前足相拥紧抱或频繁接触，这种交流持续大约2～3 min；主动伸吻的蜜蜂通常是恢复较快、爬行灵活的蜜蜂，但交流结束后，通常被动伸吻的蜜蜂能够恢复正常，而主动伸吻的蜜蜂最终不能恢复正常而死亡。当2只蜜蜂进行交流时，偶尔会引来第三只爬行灵活的蜜蜂，对着2只正在交流的蜜蜂主动伸吻，但通常情况下，“第三者”都难以参与进2只蜜蜂间的交流，1～2 min后便主动地离开。我们推测交流的蜜蜂之间可能存在食物的传递，但完全冻僵的蜜蜂在复苏过程中出现交流现象的机制及其意义还有待进一步的研究。

4 结论

（1）根据观察，东方蜜蜂在完全冻僵过程和复苏过程中，其足、触角、翅、吻及腹部等器官和部位均发生了较为复杂的行为活动变化，蜜蜂冻僵过程大致可分为轻度冻僵、中度冻僵、重度冻僵和完全冻僵四个阶段，而完全冻僵的蜜蜂复苏过程可分为复苏萌动、完全苏醒、积极状态三个阶段。

（2）从冷藏条件对东方蜜蜂冻僵效果和恢复效果的影响来看，当冷藏温度一定时，随着冷藏时间的延长，完全冻僵的蜜蜂比例逐渐增加，而冷藏后室温下能恢复正常的蜜蜂比例逐渐降低；当冷藏时间一定时，冷藏的温度越低，蜜蜂完全冻僵比例越高，同时蜜蜂完全冻僵状态出现的越早，而冷藏后室温下蜜蜂复苏的过程恰好相反，冷藏的温度越高，恢复正常的蜜蜂比例也越高。从冷藏条件对蜜蜂复苏时间的影响看，总体上当冷藏时间一定时，冷藏温度愈高，蜜蜂恢复至振翅飞行所需时间愈短，当冷藏温度一定时，随着冷藏时间的增加，蜜蜂恢复至振翅飞行所需时间愈长。

[1]曾志将.蜜蜂生态学[J].江西农业大学学报, 1989, (增刊): 13-15.

[2]曹义锋, 余林生, 毕守东, 丁建.温度对蜜蜂影响的研究进展[J].蜜蜂杂志, 2007, (4):13-15.

[3]格菲塔兰诺夫著, 江西省养蜂研究所编译.蜂群生物学[M].南昌：江西科技出版社，1992,3-8.

[4]泰经勋，李树珩.气候因素对蜂群的影响[J].特种经济动植物，2004，（7）：9-10.

[5]赵晓峰，刘新生，李化龙，赵变茂.冬季外界环境温度变化对中、意蜜蜂箱内温度影响的试验分析[J].陕西农业科学，2008，54(4)：35-38.

[6]邹钟琳.昆虫生态学[M].上海:上海科学技术出版社.1983, P.25-26.

[7]杨冠煌, 肖京城.中华蜜蜂群体内温度,湿度及CO2浓度的变化及调节研究[J].中国农业科学，1999，32(3)：96-101.

[8]周冰峰, 林世煌,苏静，薛奋勤，江天宝.温度对蜜蜂受精卵和封盖王蛹发育的影响[J].福建农林大学学报：自然科学版，2002，31(4)：511-513.

[9]余林生，曹义锋，邹运鼎，毕守东.中华蜜蜂群体内温度变化及调控的研究[J].南京农业大学学报，2006，29(4)：53-58.

[10]周冰峰，李月，朱翔杰，陈文锋，周宇，张星，陈焰煌.封盖期发育温度对蜜蜂前翅翅脉增加的影响[J].中国蜂业，2007，58(5)：5-8.

[11]汪正威，杨明显，李华，谭垦.东、西方蜜蜂蜂群的温度调节比较研究[J].中国蜂业，2010(11)：22-23.

[12]梁勤, 陈大福.温度,相对湿度和pH对蜜蜂球囊菌孢子萌发的影响[J].应用生态学报，2000，11(6)：869-872.

[13]王丽华, 方兵兵.封盖子的温、湿度在控制条件下对白垩病发生的影响[J].中国养蜂，2002，53(4)：49-50.

[14]王树兴，李位三.温度对蜜蜂群体越冬生命活动的影响[J].生态学杂志，1995,14（2）：61-63.

[15]战书明，李树珩.浅谈气候因素对蜂群的影响[J].养蜂科技，2005，（5）：11-12.

[16]刁爱国.温度在蜜蜂生活中的变化[J].养蜂科技，1997，（5）:14.