萝卜与苤蓝属间杂种胚离体培养

甘彩霞，何云启，崔磊，梅雪飞，梅时勇

（湖北省农科院经济作物所，武汉，430064）

萝卜（Raphanus sativus L.）是我国栽培的主要蔬菜作物之一，其为十字花科萝卜属一、二年生草本植物。原产我国，各地均有栽培，品种极多，常见有白皮萝卜、红皮萝卜、青皮萝卜等。以根供食用，鲜食生食均可，种子含油42%，可用于制肥皂或作润滑油。种子、鲜根、叶均可入药，可下气消积。生萝卜含淀粉酶，能助消化[1]。

苤蓝 （Brassica oleracea var.carlorapa D.C.）又名球茎甘蓝，俗名擘蓝、玉蔓青，为十字花科芸薹属一、二年生草本植物。其为甘蓝的变种，食用部分为肉质球茎，质脆嫩，可鲜食及腌制。苤蓝依球茎的色泽可分为绿白色、绿色及紫色3种；依生长期的长短可分为小型的早熟种和大型的晚熟种。长江流域生长期较短，应栽培早、中熟品种。苤蓝适应性强，易栽培，耐贮藏、运输。其生物学物征、特性，栽培管理技术，均与甘蓝相似[2]。萝卜和苤蓝均为根用蔬菜，但两者的风味不同，到目前为止，还没有两者远缘杂交研究方面的报道。为此，本试验对两者进行属间杂交，初步研究杂交亲和性的表现，以及对杂种胚抢救培养方法进行探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以7株萝卜DH303A雄性不育系（2n=18）植株为母本， 分别挂牌标记为 A、B、C、D、E、F、G 株，以苤蓝为父本。试验在湖北省农业科学院蔬菜科技研究中心基地完成。

1.2 试验方法

①杂交方法 在母本抽薹后开花前进行单株隔离，防止与其他十字花科植株串粉；开花后取父本有粉花朵对母本进行重复授粉，挂牌标记杂交组合、花朵数和授粉时间。授粉后跟踪观察荚的生长发育情况，并测量杂种荚的长度和横径。

②杂种胚抢救 远缘杂交中，杂种胚往往是败育的，因而需要对杂种胚胎进行胚抢救，需要在胚胎败育之前获取离体胚胎，根据观察所得经验，取授粉后3～7 d的荚，进行胚胎抢救。其胚胎抢救的培养基如下，诱导培养基：MS+2，4-D 2.0mg/L+KT 0.5 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%；继代培养基：MS+2，4-D 2.0mg/L+KT 0.5mg/L+蔗糖 3%+琼脂 0.6%；分化培养基：MS+IAA 0.5 mg/L+KT 1.5 mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%；生根培养基：MS+NAA 0.2mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖3%+琼脂0.6%。

胚抢救过程如下，a.取材。考虑到目的材料的含水量，非雨天在10：00以后采荚，雨天一般在14：00后取材。采取授粉后3～7 d的正常生长荚，连同果柄一同摘取。

b.材料处理。将材料置于烧杯中，加清水将材料清洗片刻，切除果柄备用。在超净工作台上将材料置于小烧杯中，用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%HgCl2溶液浸泡8min，最后用无菌水冲洗3次，每次3min。

c.接种。将荚果置于灭菌牛皮纸上，剥出胚珠接种于诱导培养基上。

d.培养。将接种后的培养基置于温度25℃、光照时间16 h/d、光照强度2 000～3 000 lx的培养室中进行培养。30 d左右，诱导出胚性愈伤组织。然后将胚性愈伤组织转移到继代培养基上培养。15 d左右，将愈伤组织接种到分化培养基上。待绿芽长到2～3 cm时，转到生根培养基上培养。

e.炼苗。打开瓶口，在培养室炼苗2～3 d，转到自然条件下炼苗2～3 d。

f.移栽。洗去小苗表面的培养基，移栽到小盆里，成活后移栽到大田。

2 结果与分析

2.1 萝卜×苤蓝杂交亲和性表现

将苤蓝的花粉授在萝卜的柱头上后，观察杂种荚的生长发育情况。授粉后第2天花瓣和雄蕊脱落；第3天荚有膨大迹象；第4天可见荚较明显膨大；第5天荚明显膨大；第6天可见子房微凸起；第7天部分荚在膨大部分出现黄绿色，其他荚继续膨大；第8天可见大部分黄荚，初步分析，黄绿荚的出现可能就是胚胎败育的开始，黄荚为完全败育荚；第9天黄荚开始萎蔫，并且数量增多。

萝卜与苤蓝共杂交1 739朵花，第2天结荚数为1 651个，占授粉花数的95%，第3天的结荚率为88%，说明此期授粉和受精过程是亲和的，而且亲和性很高。同时也观察到从第3天开始出现胚败育，随时间的延长，败育率逐渐提高，到第9天，已有75%的胚败育，第10天，胚胎败育率达84%，而到第12天，杂交荚全部死亡，败育率达100%。表1的结果说明，萝卜和苤蓝杂交后的不亲和性发生在胚珠的形成过程中。

2.2 萝卜×苤蓝杂交荚生长速率

授粉后测量30个荚的长度和横径，取其平均值，观察杂交荚的生长。由表2可知，荚长在第2～5天生长快，增长率在17.2%～33.8%，随后生长非常缓慢；荚横径的快速生长期是在授粉后第2～4天，随后生长非常缓慢，速度趋于缓慢。至第7天，大部分荚开始败育，甚至生长趋于停止。

2.3 萝卜×苤蓝杂种胚培养成苗率

本次胚胎抢救试验按照授粉后荚生长时间梯度设置4组，每组4个重复，每个重复取目的材料即胚珠30粒。由表3可知，自然条件下，杂交荚生长期为4 d的胚珠经离体培养，成苗率为3.3%；生长期为5 d和6 d的胚珠经离体培养，成苗率为5%；生长期为7 d的胚珠经离体培养，成苗率为1.6%。因此，以第5天和第6天胚珠离体培养的成苗率较高。

3 结论与讨论

①萝卜与苤蓝杂交的不亲和性发生在胚珠发育过程中。造成胚胎败育的原因有多种，但从目前有关的研究成果看，这些原因大致可归纳为七类：胚囊发育异常、胚乳发育异常、幼胚起源、营养供应失调、内源激素、酚类物质、某些酶活及基因调控。归纳起来它们大多有一个共同的特征，即这些胚较之亲本产生了幅度过大的变异，导致变异胚要么自身生长不协调而死亡、要么自身和亲本不协调而死亡[3～10]。十字花科植物之间进行属间、种间的杂交时，往往出现胚珠的不育现象[11～15]。在荚果长到一定程度以后就会黄化，即杂种胚胎已经开始败育，本试验中也获得类似的结果。

表1 萝卜×苤蓝杂交若干天后的结荚数

表2 萝卜×苤蓝杂交荚生长速率统计

表3 萝卜×苤蓝杂种胚培养成苗率

②杂交荚荚长快速生长期是在授粉后的第2～5天，而横径快速生长期是在授粉后第2～4天。

③杂种胚适宜的抢救期是在授粉后第6天、第7天。不同物种胚胎抢救的最佳时间不一样，陈树忠等[16]对甘蓝型油菜和羽衣甘蓝杂交子房培养的研究结果表明，取授粉后第10天子房培养获得种子成功率较高。

孟金陵[17]曾对芸薹属及近缘种属植物远缘杂交不亲和性问题作过比较全面的专门综述，并对甘蓝型油菜与近缘种属植物远缘杂交时花粉雌蕊相互作用作了研究。这对于探讨克服油菜与其近缘种属植物远缘杂交不亲和性障碍、提高杂种获得率均具有理论和实际意义。胡大有等[18]认为萝卜与油菜的远缘杂交存在严重的生殖障碍，本次试验也遇到了杂交不亲和的障碍，我们采用重复授粉法提高其亲和性。目前关于芸薹属植物与萝卜之间远缘杂交不亲和性障碍的研究报道很少，原因尚不清楚，需要进一步的研究。

[1]汪隆植，何启伟.中国萝卜[M].北京：科学技术文献出版社，2005：1-21.

[2]王跃兵，李玉玲.水果苤蓝优质丰产栽培技术[J].河北农业科学，2009，13（2）：26-27，29.

[3]刘宏波，刘忠松.油菜远缘杂交亲和性研究进展[J].作物研究，2006（5）：456-458.

[4]贺佳玉，李云，姜金仲，等.植物胚败育机理及其离体培养挽救技术之研究进展[J].中国农学通报，2008（1）：141-146.

[5]罗鹏，王幼平.海甘蓝与芸薹属间杂交的受精和胚胎发育[J].作物学报，1997，23（5）：538-544.

[6]邢少辰，周开达，蔡玉红.植物远缘杂交的研究[J].吉林农业科学，2000（4）：18-21.

[7]王国槐，官春云，陈社员，等.油菜雄性不育系与十字花科蔬菜远缘杂交亲和性研究[J].湖南农业大学学报：自然科学版，2000，26（5）：337-339.

[8]唐征，刘庆，张小玲，等.甘蓝型油菜与青花菜种间杂种子房离体培养研究[J].中国农学通报，2006，22（10）：93-96.

[9]谈晓林，崔光芬，郑思乡，等.百合不同离体授粉方法的杂交结实研究[J].西南农业学报，2011，24（1）：270-274.

[10]石海春，李莹，柯永培，等.玉米远缘选系主要性状的遗传及配合力分析[J].玉米科学，2011，19（1）：14-20.

[11]程雨贵，吴江生，华玉伟，等.萝卜与甘蓝属间杂种基因组原位杂交分析[J].遗传，2006，28（7）：858-864.

[12]程雨贵，吴江生，陈洪高，等.萝卜和甘蓝远缘杂交研究[J].中国油料作物学报，2006（1）：1-6.

[13]赵洪朝，杜德，刘青元，等.芥菜型多室油菜与甘蓝型油菜的种间远缘杂交[J].西北植物学报，2003（9）：1 587-1 591.

[14]周清元，李加纳，殷家明，等.白菜型油菜和羽衣甘蓝种间杂交的初步研究[J].西南农业大学学报：自然科学版，2003，25（6）：495-497.

[15]赵云，潘涛，王茂林.油菜与诸葛属间远缘杂交的初步研究[J].中国油料，1993（1）：7-9.

[16]陈树忠，殷家明，唐章林，等.甘蓝型油菜与羽衣甘蓝远缘杂交初步研究[J].西南农业大学学报，2000（3）：208-210.

[17]孟金陵.芸薹属植物远缘杂交不亲和性的研究进展[J].中国油料作物学报，1987（4）：71-77.

[18]胡大有，王爱云，李栒.萝卜与甘蓝型油菜和黑芥的远缘杂交亲和性研究[J].作物研究，2006（2）：124-126.