mTOR siRNA对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞生物学行为的影响

郭秀玲

(郑州华信学院，河南 郑州451150)

喉鳞状细胞癌是人类头颈部好发的恶性肿瘤之一，目前其主要的治疗方法是手术、放疗、化疗，但疗效均不够理想。RNA 干扰技术是近几年发展起来的基因沉默技术，其原理是利用双链RNA 特异性降解具有同源序列的mRNA，从而阻断相应基因的表达［1］。RNA 干扰具有高效、高特异性等优点，为多种疾病，特别是恶性肿瘤的治疗开拓了新思路，因此寻找和发现喉鳞状细胞癌新的预后和治疗基因显得十分重要。

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是P13K/Akt/mTOR 信号转导通路的下游有效蛋白之一，可以整合氨基酸、能量、生长因子所激发的信号通路，参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体生物合成和细胞生长、细胞凋亡、细胞迁移等生理过程，而这些过程都与肿瘤的发生发展密切相关。研究［2-3］发现，许多肿瘤伴有mTOR 信号通路调节异常。雷帕霉素能特异性靶向抑制mTOR，从而抑制细胞生长。研究［4-5］发现，雷帕霉素能抑制部分肿瘤细胞株，其中对乳腺癌、卵巢癌、白血病、肺癌、肾癌等肿瘤细胞株的生长抑制明显。本研究通过转染mTOR siRNA 及应用雷帕霉素于喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞后一些指标的变化，观察mTOR siRNA 对mTOR 蛋白表达及细胞增殖能力的影响，以期为喉鳞状细胞癌的分子治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料 选取郑州大学第一附属医院病理科存档的45 例喉鳞状细胞癌组织和45 例正常喉黏膜组织标本，并采用免疫组织化学法检测其mTOR 蛋白的表达。

1.2 细胞系 人喉鳞状细胞癌细胞系Hep-2 购自上海中科院细胞库，在含有体积分数10%胎牛血清、100 u·mL-1青霉素、100 μg·mL-1链霉素的RPMI-1640培养基中生长，并置于37 ℃、体积分数5% CO2的条件下培养，实验细胞均处于对数生长期。

1.3 主要试剂 mTOR siRNA、对照siRNA、mTOR 抗体、β-actin 均购自美国Santa Cruz 公司;CCK-8 试剂盒购自中国Beyotime 生物技术有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞培养、分组及转染 将喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞复苏培养于含体积分数10%胎牛血清的RPMI-1640 培养基中，根据mTOR siRNA 治疗情况，将细胞分为5 组:空白对照组(不作任何处理)、空载体组(利用对照siRNA 进行治疗)和3 个mTOR siRNA组(利用mTOR siRNA 进行治疗，低、中、高浓度组mTOR siRNA 浓度分别为50、100、150 nmol·L-1);根据雷帕霉素治疗情况，将细胞分为5 组:正常对照组、溶剂对照组和3 个雷帕霉素组(低、中、高浓度组雷帕霉素浓度分别为100、150、200 nmol·L-1)。

1.4.2 Western bolting 法检测蛋白 于24、48、72 h分别收集mTOR siRNA 及雷帕霉素处理后各组喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞，加入蛋白裂解液，匀浆后12 000 ×g低温离心30 min，取上清液，测定蛋白浓度。采用质量分数10% SDS-PAGE 进行蛋白电泳，蛋白上样量为每孔60 μg，电泳后采用湿转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，质量分数5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入1∶200稀释的mTOR 抗体，4 ℃反应过夜，洗膜后，加入1∶5 000 稀释的二抗室温反应1 h，暗室曝光，结果采用Gene Tools 软件进行蛋白相对表达分析。

1.4.3 CCK-8 法检测细胞增殖情况 于24、48、72 h分别收集mTOR siRNA 处理后各组喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞，每孔加入10 μL CCK-8 溶液(加入的体积一般为原来培养液体积的10%);细胞培养箱内继续孵育0.5 ～4 h，于酶标仪上测定450 nm 处吸光度，并绘制喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞的增殖曲线。

1.5 统计学处理 所有的结果采用SPSS 13.0 进行统计学处理，计量数据以±s表示，2 组数据间比较用独立样本t检验，3 组及以上数据比较用单因素方差分析及LSD-t检验;计数资料的比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 喉鳞状细胞癌组织和正常喉黏膜组织中mTOR蛋白的表达 mTOR 蛋白阳性表达主要位于肿瘤细胞的细胞质中，阳性信号呈不同程度的黄色。mTOR 蛋白在喉鳞状细胞癌组织中表达的阳性率显著高于正常喉黏膜组织，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1、图1。

表1 mTOR 蛋白在喉鳞状细胞癌组织和正常喉黏膜组织中的表达

图1 mTOR 在喉鳞状细胞癌组织和正常喉黏膜组织中的表达(DAB，×200)

2.2 mTOR siRNA 对喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞中mTOR 蛋白表达的影响 3 种不同浓度的mTOR siRNA 分别转染喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞24、48、72 h，与空白对照组、空载体组相比，mTOR siRNA 转染的各组各时点mTOR 蛋白的表达均明显降低(P＜0.05)，且mTOR 蛋白的表达随mTOR siRNA 浓度的增加、处理时间的延长而减低(P＜0.05);各时点空白对照组与空载体组mTOR 蛋白的表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2、图2。

表2 mTOR siRNA 转染组mTOR 蛋白的表达情况

图2 mTOR siRNA 高浓度组处理72 h 后mTOR 蛋白的表达情况

2.3 雷帕霉素对喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞中mTOR 蛋白表达的影响 3 种不同浓度的雷帕霉素处理喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞24、48、72 h，各组各时点与溶剂对照组及正常对照组相比，mTOR 蛋白的表达量均有所降低(P＜0.05);且mTOR 蛋白的表达随雷帕霉素浓度的增加、处理时间的延长而降低(P＜0.05);溶剂对照组及正常对照组mTOR 蛋白的表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3、图3。

表3 各雷帕霉素组mTOR 蛋白的表达

图3 雷帕霉素高浓度组处理72 h 后mTOR 蛋白的表达情况

2.4 mTOR siRNA 对喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞增殖能力的影响 利用CCK-8 分析转染后24、48、72 h 喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞增殖的变化，结果显示，与空白对照组、空载体组相比，各mTOR siRNA 组喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞的增殖在转染后的24、48、72 h 均受到明显抑制(P＜0.05);空白对照组、空载体组在转染后监测的各时点细胞增殖比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见图4。

图4 mTOR siRNA 处理后喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞增殖情况

3 讨论

肿瘤的发生进展非常复杂，其机制与众多的生长因子信号通路异常有关。单独利用分子靶向药物或与其他治疗方式联合应用，对这些生长因子信号通路进行分子靶向治疗将有助于形成一种新的肿瘤生物治疗模式。分子靶向治疗能够特异性作用于肿瘤信号通路中的关键靶点，阻断相关信号的传递以影响肿瘤细胞的生长和代谢，进而达到治疗肿瘤的目的［6-8］。

mTOR 属于磷脂酰肌醇激酶相关的蛋白激酶超家族成员，作为Ser/Thr 激酶而起作用。mTOR 信号通路被认为是一个调节细胞周期进程和细胞生长的信号汇聚点。由于mTOR 在细胞增殖、分化、转移和存活中的重要地位，mTOR 已经成为肿瘤治疗中的一个新靶点［9-10］。

雷帕霉素是一种大环内酯类抗生素，能特异性靶向抑制mTOR，具有靶向抗肿瘤细胞作用，可将肿瘤细胞阻滞在G1期，使肿瘤细胞生长受抑制并最终阻滞细胞的增殖，甚至诱导细胞凋亡，同时也能抑制肿瘤血管形成，抑制肿瘤侵袭和转移。雷帕霉素对不同肿瘤细胞株的抑制作用不一，同一肿瘤的不同细胞株之间对雷帕霉素的敏感度也存在差异［11］。因此，本研究利用RNA 干扰技术及雷帕霉素作用于喉鳞状细胞癌Hep-2细胞，通过观察其mTOR 蛋白表达及增殖能力的变化，以期为喉鳞状细胞癌的分子治疗提供理论依据。

我们的研究发现，mTOR 在喉鳞状细胞癌组织中高表达，在正常喉黏膜组织中低表达。而mTOR 在喉鳞状细胞癌组织中的高表达提示在临床治疗中使用mTOR 抑制剂治疗可能获得较好的治疗效果。应用3种不同浓度的mTOR siRDA 和雷帕霉素处理喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞，发现mTOR siRNA 和雷帕霉素能下调mTOR 的表达，且mTOR siRNA 还能抑制喉鳞状细胞癌Hep-2 细胞的增殖，这种作用还具有时间和浓度依赖性。目前，雷帕霉素虽没有在临床上用于喉鳞状细胞癌的治疗，但一系列的研究结果提示，随着对mTOR 通路的研究深入，雷帕霉素及同类药物可能成为喉鳞状细胞癌靶向治疗的新思路。

综上所述，本研究利用RNA 干扰技术进一步明确了mTOR 在喉鳞状细胞癌发生发展中的作用，初步探讨了利用mTOR 抑制剂靶向治疗喉鳞状细胞癌的价值，这为喉鳞状细胞癌的分子治疗提供了一定的理论依据。

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