豇豆胰蛋白酶抑制剂不同组分的制备方法

金宪雷，张泉霖，杜林方 ，刘 科

四川大学生命科学学院，成都610064

在正常的细胞代谢中，蛋白酶抑制剂扮演着重要的角色。蛋白酶抑制剂构成了控制蛋白酶活性的最后的调节步骤。在生理调节中，蛋白酶抑制剂和蛋白酶达到一个动态的生物平衡［1，2］。Read 和Haas 第一次证明，豆粉中含有只能抑制胰蛋白酶活性的蛋白(STI)和能同时抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白(BBI)［3］。在过去的二十多年间，人们普遍认为，BBI 是一种抗营养的物质。BBI 类的胰蛋白酶抑制剂，会在叶子受伤后表达分泌，是一种天然的抗虫物质［4］，目前已经在转基因抗虫领域得到广泛的应用［5］。近年来，体外实验已经证实，单独的BBI 类的胰蛋白酶抑制剂是一种抗癌症的物质，在纳摩尔含量下即起效，并对癌症细胞有不可逆的作用［6，7］。因此，寻找及利用胰蛋白酶抑制剂是极具研究价值的。豆科(Leguminosae)豇豆属(Vigna)植物豇豆，是一种优质的蛋白质资源。Sammour 等人证明豇豆中含有四种胰蛋白酶抑制剂(Cowpea trypsin inhibitor，CPTI)［8］，本文探讨了豇豆中不同组分的制备方法。

1 材料和方法

1.1 材料

豇豆(Vigna unguiculata var.)种子购自市场;中分子量标准蛋白、丙烯酰胺(Acr)为Sigma 产品;牛胰蛋白酶(Bovine Trypsin)、Na-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐(BAPAN)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)为Fluka 产品;葡聚糖凝胶(Sephadex G-150)为Phamarcia 公司产品;DEAE-52 纤维素为Whatman 公司产品;Sephacryl s-300 凝胶过滤柱为GE 公司产品;牛血清白蛋白(BSA)，为上海丽珠公司产品;其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 豇豆种子胰蛋白酶抑制剂粗品的制备

乙酸钠抽提法:参照文献［9］的方法略加改进。取150 g 豇豆种子研碎，用600 mL 无水乙醚于4 ℃分三次搅拌脱脂。自然挥干乙醚后，再用1.5 L 0.2 mol/L 乙酸钠于4 ℃下分两次抽提(第一次800 mL，第二次700 mL)，每次12h。合并两次上清液，离心(10 000×g，60 min，4 ℃)，弃沉淀;调上清液的pH 至6.0，边搅拌边加入固体硫酸铵至50% 饱和度，4 ℃下放置过夜，离心(10 000 × g，25 min，4℃)，弃去沉淀。上清液的pH 再调至6.0，边搅拌边加入固体硫酸铵至70%饱和度，4 ℃下放置4 h，离心(10 000 ×g，25 min，4 ℃)。沉淀用少量去离子水溶解，对缓冲液A(0.05 mol/L Tris-Hcl，pH 8.0)充分透析，离心(10 000 ×g，15 min，4 ℃)所得上清液，即为抑制剂粗提物。

1.2.2 豇豆种子胰蛋白酶抑制剂的纯化

将抑制剂粗提物分批上样至经缓冲液A 预先平衡的Sephadex G-150 凝胶过滤柱(3. 2 cm ×56 cm，流速20 mL/h)，收集活性峰，合并后对缓冲液A充分透析，离心(10 000 ×g，15 min，4 ℃)，上样到预先经缓冲液A 平衡的DEAE-52 离子交换层析柱(1 cm×5 cm，流速20 mL/h)，收集穿透峰中的活性物质，并命名为Pool I，再经用含相同缓冲液的0.1～0.5 mol/L NaCl 线性梯度洗脱，收集得到一个活性峰，命名为Pool II。Pool I 经浓缩后，对去离子水充分透析，离心(10000 × g，15 min，4 ℃)，然后进行FPLC 纯化分析，样品分批上样至经0. 1 mol/L NH4HCO3平衡后的Sephacryl S-300 柱，并且用同样的缓冲液洗脱，洗脱速度为3.9 mL/h，得到两个活性峰命名为CPTI IA 和CPTI IB。

1.2.3 胰蛋白酶抑制剂活性的测定

1.2.3.1 明胶-PAGE 活性电泳法

按照文献［9］的方法进行。

1.2.3.2 含SDS 的明胶活性电泳

按照文献［10］的方法进行

1.2.3.3 BNPAN 法

参照文献［11］略加改进，取一定量胰蛋白酶分别与不同胰蛋白酶抑制剂制备物混合，于3 mL 酶解缓冲液(含0.01 mol/L CaCl2的0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0)中37 ℃保温5 min，加入适量0.025 mol/L BNPAN，37 ℃温育10 min 后，再加0.5 mL 33% 乙酸终止反应，410 nm 波长处测定光吸收值。每降低0.1 个A410为一个CPTI IB 抑制活性单位(U)。

1.2.4 蛋白质浓度的测定

采用Brandford 法［12］。

2 结果和分析

2.1 豇豆胰蛋白酶抑制剂粗提物制备与凝胶过滤初步分离

豇豆种子经过研磨、乙醚脱脂、乙酸钠抽提、50%～70%硫酸铵分部盐析与透析，得到粗提物。经Bradford 法测定，150 g 豇豆种子制备得到的粗提物含有1050 mg 蛋白质，用1.2.3.3 的方法测定，其对胰蛋白酶的抑制比活为50.37 U/mg。样品粗提液稀释50 倍和100 倍后进行明胶活性电泳(图1A)和SDS-PAGE(图1B)。胰蛋白酶抑制剂会形成自聚体，所以在活性电泳时会形成数量不等的条带，在图1A 中我们看到，当蛋白质浓度降低时，自聚体现象减弱。

图1 硫酸铵分级沉淀后的明胶活性电泳和SDSPAGE.Fig.1 Active-staining of gelatin PAGE and SDS-PAGE analysis of Ammonium sulfate precipitation.

CPTI 粗提物(含有308.7 mg 蛋白)对缓冲液A充分透析后，取20 mL 上样到Sephadex G-150 凝胶过滤层析柱(3.2 cm ×56 cm)，经缓冲液A 充分洗脱，洗脱速度为20 mL/h，每管10 mL，图2A 为层析图谱.对洗脱液进行胰蛋白酶抑制活性测定，发现10～20 管含有胰蛋白酶抑制剂活性。

图2 Sephadex G-150 凝胶过滤层析图谱、明胶活性电泳及SDS-PAGEFig.2 Gel filtration chromatography，Active-staining of gelatin PAGE and SDS-PAGE analysis

取前30 管按照1.2.3.1 的方法进行活性电泳，分离胶含0. 5% 的明胶，电流为1 mA/孔，电泳完后，胶板浸在含有25 μg/mL 胰蛋白酶的100 mmol/L 的Tris -Hcl (pH 8.0)中，处理40 min，其结果见图2B。选取有抑制剂活性的11-13 管进行SDS-PAGE分析，结果如图2C 所示，在胶板的下缘均有条带，说明这部分与抑制剂活性相关。

2.2 离子交换层析分离组分I 与组分II

收集凝胶过滤中有抑制剂活性的样品，合并11-13 管，并对缓冲液A 充分透析，离心，样品浓缩后取5 mL 上样到DEAE-52 纤维素阴离子交换柱(3.2 cm ×20 cm)，先用缓冲液A 洗脱，收集穿透峰，洗脱速度为20 mL/h，每管10 mL，共收集12 管。活性测定结果表明，穿透峰仍具有活性，作为组分I(图3A 中Pool I 部分)。换用含相同缓冲液A 的0.1～0.5 mol/L NaCl，进行线性梯度洗脱，洗脱速度为20 mL/h，每管10 mL。活性测定结果表明，在0.1 mol/L NaCl 时洗脱下的样品有活性，作为组分II(图3A 中Pool II 部分)。

对前30 管样品按照1.2.3.1 的方法进行活性电泳检测，图3B 显示了电泳结果。结果显示，在穿透峰的3～5 管有胰蛋白酶抑制剂存在，对应着组分I。在洗脱峰的14～18 管有胰蛋白酶抑制剂存在，对应着组分II。取4、5、15、16 管进行SDS-PAGE 分析，结果如图3C，我们可以看到通过离子交换层析已经除去了大部分蛋白，尤其穿透峰中杂蛋白含量已经明显较少。

图3 DEAE-52 离子交换层析、明胶活性电泳及SDSPAGE 分析Fig.3 Ion exchange chromatography on DEAE-52，Activestaining of gelatin PAGE and SDS-PAGE

2.3 通过Sephacryl S-300 层析分离CPTI IA 和CPTI IB

收集的组分I 对去离子水充分透析，离心(10000 ×g，15 min，4 ℃)，浓缩后取6 mL 上清液进行FPLC 纯化。分批上样至经0.1 mol/L NH4HCO3平衡后的Sephacryl S-300 凝胶过滤柱，并且用同样的缓冲液洗脱，洗脱速度为3.9 mL/h，每管2 mL。如图4A 所示，洗脱下两个蛋白峰，经活性测定都有抑制剂活性。

取第一个峰对应的15～20 号管和第二个峰对应的25～35 管按照1.2.3.2 的方法进行活性电泳检测，电泳结果见图4B。取第32 和33 管进行SDSPAGE，图4C 显示有单一的条带，说明已经得到了CPTI IB。

图4 FPLC 的sephacryl s-300 凝胶过滤层析及活性电泳Fig.4 Gel filtration chromatography on sephacryl s-300 and active-staining of gelatin PAGE and SDS-PAGE

3 结论

综上所述，本文通过几种分离纯化方法探讨了豇豆胰蛋白酶抑制剂不同组分的制备方法，并运用两种活性电泳方法对各组分进行了活性测定，同时对各组分也进行了SDS-PAGE 分析。最后经过Sephacryl S-300 层析分离了CPTI IB 蛋白，经过SDS-PAGE 鉴定，其含有单一的条带，其理化性质有待进一步研究。

对于其他的组分的纯化，可对相应的组分做进一步的FPLC 层析，本文为分离提纯几种胰蛋白酶抑制剂提供了基础。

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