三刺皂荚黄化病植原体的分子鉴定

都业娟，李成亮，石宝萍，向本春

(石河子大学新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室，新疆石河子 832003)

植原体(Phytoplasma)原称类菌原体(MLO)，属柔膜菌纲，是重要的病原微生物。主要由取食植物韧皮部的叶蝉、飞虱等昆虫传播，可危害粮食、蔬菜、花卉、林木、杂草等各类植物，感病植株表现出黄化、顶枯、丛枝、簇生、花变叶、矮化、小叶等症状［1-2］。目前世界上已报道的植原体病害有1 000多种，我国迄今已报道的植原体病害有100余种［3］。由于植原体不能离体培养，所以不能用传统的真菌和细菌的方法进行系统的分类鉴定。目前植原体分类主要依赖分子生物学方法，尤以植原体的一些保守序列，如16S rRNA基因序列、核糖体蛋白基因(rp)、延伸因子(tuf)基因、16-23S rRNA间区序列(16S-23S rRNA space region)、转运蛋白(SecY)基因等，在检测和鉴定中的应用越来越多［4］。

三刺皂荚Gleditsia triacanthos Lam.，豆科皂荚属，又名三刺皂角、美国皂角，原产北美地区，后引进我国新疆、北京、山东、江苏等地，是国外利用最广，研究最深的一种皂荚。其具有耐干旱、耐盐碱、生长速度适中、木材密度高、坚硬、耐用的优点，是广泛作为防风固沙林、经济林、用材林、绿化林的优良树种。本研究对采自新疆石河子地区表现黄化症状的三刺皂荚的病原，即植原体16S rRNA，16S-23S间区序列及tuf基因采用巢氏PCR进行分子生物学研究，明确三刺皂荚黄化病病原及株系的分类地位。

1 材料与方法

1.1 材料 2012年8月在新疆石河子采集健康的和表现黄化症状的三刺皂荚样品。

1.2 总 DNA提取 参照 Qi等［5］的方法提取总DNA，分别提取感病及健康植株总 DNA，保存在-20℃冰箱中备用。

1.3 巢式PCR扩增 利用Nested-PCR对植原体的16S rRNA，16S-23S rRNA间区序列和tuf基因进行扩增。其中引物对 P1/P7［6］分别与 R16F2n/R16R2［7］，SR1/SR2［8］组合用于植原体 16S rRNA和16S-23S rRNA间区序列基因的扩增;tuf基因利用引物对 fTuf1/rTuf1和 fTufu/rTufu［9］组合扩增(表1)。

表1 用于植原体16S rRNA，16S-23S rRNA间区及tuf基因扩增的引物序列

1.4 核苷酸序列的测定与分析 PCR产物回收后连接载体并转化大肠杆菌DH5α，取白色菌落培养并提取质粒。通过PCR筛选鉴定阳性克隆，送北京华大基因公司测序。

所得序列通过Blast在NCBI中搜索同源序列。利用DNAMAN和DNASTAR进行核苷酸分析;利用MEGA 5.0通过最小进化法(Minimum-Evolution，ME)构建基于16S rRNA和tuf基因序列的系统进化树;并利用植原体在线分析软件iPhyClassifier对16S rRNA基因序列进行在线分析(http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi)。

2 结果与分析

2.1 16S rRNA，16S-23S rRNA间区序列及tuf基因PCR扩增结果 以表现黄化症状三刺皂荚总DNA为模板，经 Nested-PCR扩增其 16S rRNA，16S-23S rRNA间区序列及tuf基因，分别得到约1.2，0.3，0.8 kb的植原体特异条带，而健康三刺皂荚植株和双纯水对照未扩增出相应条带。说明表现黄化落叶症状的三刺皂荚中存在植原体，此植原体暂命名为 Honeylocustyellowsphytoplasma(HoY)。

2.2 16S rRNA基因序列分析及系统进化树构建通过测定3个克隆确定HoY 16S rRNA基因扩增片段含1 248个核苷酸(GenBank No.KC242233)，G+C含量为45.8%。HoY与GeneBank中同源序列Blast结果显示，该株系与榆树黄化植原体组(Elm yellows group，16SrV)的枣疯病植原体(Jujubewitches′-broom phytoplasma，GenBankNO:JQ675716)、山菊苣扁茎植原体(Puna chicory flat stem phytoplasma GenBank NO:JN582266)、杏卷叶植原体(Apricot leaf roll phytoplasma，GenBank NO:FJ572660)、金钟花黄化植原体(Golden bellflower yellows phytoplasma，GenBank NO:HQ844237)、皂荚丛枝植原体(Honeylocust witches′-broom phytoplasma，GenBank NO:FJ457095)同源性均达99%以上，与河南许昌的枣疯病植原体(JQ675716)同源率高达100%。将该序列用iPhyClassifier在线工具基于相似系数进行16S组及亚组的分类，结果显示其虚拟RFLP图谱与16SrV-B亚组参照株系(AB052876)的相似系数达1.00，因此认为HoY属于16SrV-B亚组。

利用MEGA 5.0构建系统进化树显示，HoY与16SrV-A，16SrV-B，16SrV-C，16SrV-D，16SrV-E 亚组聚集为同一进化分枝，并与16SrV-B亚组的AB052876，FJ457095，JQ675716 聚为一簇(图 1)。2.3 16S rRNA基因序列虚拟RFLP分析 对HoY的16S rRNA基因序列进行虚拟RFLP分析，结果显示:HoY与16SrV-B亚组的参照株系枣疯病植原体(AB052876)有相同的酶切图谱;与16SrV-A亚组的榆黄化植原体(AY197655)在HpaⅡ，RsaI酶切位点存在差异;与16SrV-C亚组的金黄色植原体(AY197645)在BfaI，HpaⅡ和RsaI等3个酶切位点存在差异，与16SrV-D亚组的金黄色植原体(AY197644)在 BfaI，BstUI，HpaⅡ和 RsaI等 4 个酶切位点有差异;与16SrV-E亚组的悬钩子矮化植原体(AY197648)在 BfaI，HpaⅡ，KpnI和 RsaI等 4 个酶切位点有差异(图2)。

图1 HoY及其它植原体基于16S rRNA基因序列的系统进化树

2.4 16S-23S rRNA间区序列分析 通过测定3个克隆确定HoY 16S-23S rRNA间区序列扩增片段含265个核苷酸(GenBank No.KC331053)，G+C含量为32.5%。将其与GeneBank中的同源序列进行比较分析显示:HoY与16SrV组核苷酸序列同源性达97.8%～100%，并与我国报道的多个枣疯病植原体(EF661582，GU184181，FJ445389)核苷酸同源性达100%，与其他组植原体核苷酸同源性均低于92.0%。

2.5 tuf基因序列分析及系统进化树构建 通过测定3个克隆确定HoY tuf基因扩增片段由824个核苷酸组成(GenBank No.KC331043)，G+C含量为33.0%。与GeneBank中的同源序列比较，结果表明:HoY与16SrV组tuf基因核苷酸同源性均在91%以上，与我国报道的该组枣疯病植原体GU723424， GU723423， GU968760， GU968759，GU137287同源性达99.5% ～100%，与该组其他亚组植原体的同源性为91.0% ～92.6%，而与其他组植原体同源性低于85.0%。利用MEGA 5.0构建系统进化树显示:HoY与16SrV组植原体聚为同一进化分枝，并与枣疯病植原体 GU723424，GU723423，GU968760，GU968759，GU137287 聚为一簇(图3)。

图2 HoY及相关亚组植原体16S rDNA的虚拟RFLP图谱

图3 HoY及其它植原体基于tuf基因序列的系统进化树

3 讨论

本研究利用Nested-PCR扩增三刺皂荚黄化病植原体(HoY)16S rRNA，16S-23S rRNA间区序列及tuf基因，通过对其进行序列分析、构建基于16S rRNA和tuf基因的系统进化树并利用iPhyClassifier对16S rRNA基因进行RFLP在线分析，明确HoY属于榆树黄化组B亚组(16SrV-B)。通过序列比较分析可知，相对于植原体16S rRNA基因组间的高度保守，植原体的16S-23S rRNA间区序列及tuf基因存在更多的变异，但组内尤其是亚组内序列的同源性很高，可作为植原体组及亚组的划分补充依据。

我国2008年在陕西杨陵地区发现皂荚丛枝植原 体 (Honeylocustwitches′-broom phytoplasma，FJ457095)可感染中国皂荚 Gleditsiasinensis Lam.［10］，引起丛枝、矮缩、小叶等症状。本文所报道的病害发生于三刺皂荚上，且症状表现为叶片黄化、后期植株茎干枯死，二者寄主及症状均不同;针对16S rRNA基因序列进行比对，二者在1030和1223位存在2个碱基的差异。

新疆得天独厚的自然条件，非常适合葡萄、香梨、枣、杏等果树生长，随着新疆特色林果业的快速发展，新疆已成为我国重要水果产区之一，但近年相继发现杏树、枣树感染植原体病害。新疆也是我国较早将三刺皂荚引入作为绿化树种的地区，在南北疆均有分布。通过对 HoY的16S rRNA，16S-23S rRNA间区序列及tuf基因研究发现，其与我国多个枣疯病植原体在不同位点存在高度同源性。2000年后新疆大力发展枣树等特色林果种植，面积已突破73万hm2，新疆不同树种之间植原体病害存在何种关系，三刺皂荚黄化病植原体能否侵染其它果树并对新疆林果业造成危害，有待进一步深入研究。

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