一种耐低温α-乙酰乳酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

李静静， 徐美娟， 张 显， 饶志明

（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122）

双乙酰（Diacetyl，DA）是一种重要的风味物质，可以使黄油、奶油、脱脂乳和许多新鲜发酵的乳制品具有特殊风味和香气[1]。DA含量也是判断啤酒成熟与否的重要指标，啤酒中DA的口味阈值较低，只有0.02～0.10 mg/L，当其含量超过阈值时就会给啤酒带来不愉快的味道[2]。α-乙酰乳酸脱羧酶 （αacetolactate decarboxylase，α-ALDC，EC.4.1.1.5）能催化DA的前体物α-乙酰乳酸快速脱羧形成乙偶姻，避免了DA的生成[3]，它可以缩短啤酒熟化周期，提高生产效率，具有极大的经济价值。

ALDC于1952年首次从产气肠杆菌中分离得到，之后很多学者就该酶在生物界中的分布及基因克隆等展开了研究。Godtfredsen等[4]的研究表明，很多细菌具有ALDC活性，但目前在真菌、海藻和原生动物等真核生物中还未发现该酶的存在。酿酒酵母不含有ALDC基因，而细菌中天然存在的ALDC产量也很低，因此，要想将该酶应用于啤酒工业，研究ALDC的分子结构以及ALDC基因，进行基因的克隆和表达，提高酶的产量，是必然的选择。随着对ALDC分子水平研究的深入，ALDC基因已经从多种菌株中克隆得到[5-8]，并在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母中获得了不同程度的表达。高健等[9]从枯草芽孢杆菌BD-5克隆得到了ALDC基因，并在大肠杆菌中获得了表达，但是酶活不高。李联政等[8]从枯草芽孢杆菌168中扩增到ALDC基因，在大肠杆菌中表达酶活为0.11 U/mL。廖东庆等[10]将ALDC表达原件整合到枯草芽孢杆菌基因组中，得到的ALDC酶活为15.6 U/mL。有关酵母中整合表达的研究显示，ALDC表达的酶活较低。不同来源的ALDC的最适温度及稳定性等性质存在差异，已报道的ALDC最适作用温度集中在30～40℃，丹麦诺维信公司开发的ALDC酶制剂Maturex的最适作用温度也达到了35～40℃。而啤酒生产中正常的发酵温度只有10℃左右，在该温度下，ALDC酶活力只能达到其最高活力的15%～20%，这大大削弱了酶的作用效率，造成极大的浪费，同时也提高了生产成本。因此获得一种耐低温ALDC就具有了十分重要的意义。

作者所在实验室前期通过低温筛选得到一株ALDC活性较高的菌株Bacillus subtilis L5-20，获得的纯酶在啤酒发酵中进行了初步试验，能有效降低DA的含量，但原始菌ALDC的表达量偏低。本研究中以Bacillus subtilis L5-20为出发菌，克隆其ALDC基因，构建重组枯草芽孢杆菌。对重组ALDC进行Ni-NTA柱纯化，并进行了酶学性质分析，以及在5 L的发酵罐放大实验研究，以期获得高表达且更适用于啤酒发酵的ALDC，为其工业化应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

B.subtilis L5-20由作者所在实验室前期筛选获得，大肠杆菌Escherichia coli JM109和B.subtilis WB600由作者所在实验室保藏，克隆载体pMD18-T购自Takara公司，表达载体pMA5由作者所在实验室保藏。

1.2 主要试剂与培养基

工具酶、IPTG，购自TaKaRa公司；质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒、咪唑、抗生素、α-萘酚、肌酸、2-（N-马啉代）乙磺酸和 Brij35，购自上海Sangon公司；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺（American Promega Corporation）、广范围蛋白质分子量标准，购自Fermentas公司；2-乙酰基-2-甲基乙酰乙酸乙酯（ethyl-2-acetoxy-2-methylacetocetate），购自 Sigma Aldrich公司；PCR引物，由上海赛百盛基因技术有限公司合成；其他试剂均为国产试剂纯。

LB培养基:酵母粉0.5 g/dL，蛋白胨1 g/dL，NaCl 1 g/dL，pH 7.0。

发酵产酶培养基:大豆蛋白胨1 g/dL，葡萄糖4 g/dL， 玉米浆 1.5 g/dL， 尿素 0.3 g/dL，K2HPO4·3H2O 0.17 g/dL，KH2PO40.23 g/dL，MgSO4·7H2O 0.075 g/dL，NaCl 5 g/dL，pH 6.8～7.0。

1.3 主要试剂配制

酶活测定缓冲液 MES I（pH 6.0）:0.05 mol/L 2-（N-马啉代） 乙磺酸、0.05 g/dL Brij35、0.6 mol/L NaCl，用 1 mol/L NaOH 调 pH。

底物缓冲液 MESⅡ （pH 6.0）:0.05 mol/L 2-（N-马啉代）乙磺酸，用1 mol/L NaOH调pH至6.0。

显色剂:将质量分数5%α-萘酚（用正丙醇溶解）、质量分数10%NaOH、质量分数0.5%肌酸、蒸馏水按比例（1∶1∶1∶6.8）混合。 注意，显色剂要在用前配置，另外α-萘酚要避光保存。

底物:取100 μL 2-乙酰基-2-甲基乙酰乙酸乙酯，加入6 mL 0.5 mol/L NaOH，不停晃动20 min后，用0.5 mol/L HCl调pH 6.0，用MESⅡ缓冲液定容至50 mL。注意，该底物溶液需在使用前配制。

1.4 ALDC基因alsD的克隆及表达载体的构建

根据NCBI枯草芽孢杆菌的全基因组核酸序列中ALDC的基因序列，设计一对引物Forward/Reverse（见表1），在下游序列插入6个His编码基因（斜体部分），并在引物的5’端分别加上相应的酶切位点（下划线部分）。

提取B.subtilis L5-20染色体DNA为模板，以Forward/Reverse引物进行PCR扩增获得目的基因片段 alsD-His，PCR扩增条件为:94℃预变性1 min，然后 94℃变性 1 min；56℃退火 1 min，72℃延伸1 min 30 s，30个循环；72℃延伸10 min。所得基因片段经胶回收后与克隆载体pMD18-T连接，转化E.coli JM109，经过氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取阳性转化子。提取质粒酶切鉴定，将重组质粒命名为T-alsD-His，DNA测序由上海Sangon公司完成。经测序验证正确的重组质粒T-alsD-His，用BamH I和Mlu I双酶切后连接到经相同酶切的pMA5上，构建表达载体pMA5-alsD-His。

表1 文中所涉及的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 ALDC在枯草芽孢杆菌中的表达

将构建好的表达载体pMA5-alsD-His转化至B.subtilis WB600中，转化过程参照Spizizen所述的方法进行。在卡那霉素抗性平板上筛选阳性重组子，并经酶切验证。将经验证正确的重组菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600接种至含有 50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中37℃过夜培养，次日以1%的接种量转接至50 mL LB液体培养基中37℃培养16 h。将发酵液于10 000 r/min 4℃离心15 min，发酵液上清液用于重组菌胞外ALDC酶活的测定，收集菌体，用0质量分数.85%NaCl洗涤2次，然后悬浮于MES I（pH 6.0）缓冲液中。采用超声波细胞破碎法破碎细胞（300 W，工作2 s停5 s，工作时间 10 min），15 000 r/min 4 ℃离心 30 min，所得上清液用于重组菌胞内ALDC酶活的测定。

1.6 酶的Ni-NTA纯化

发酵后离心收集菌体，用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤3次，重悬于McAc-0溶液 （20 mM Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，质量分数 10% 甘油），采用超声破碎制得粗酶液，经0.45 μm滤膜过滤后，采用Ni-NTA蛋白纯化柱纯化目的蛋白质，经过两次上样，依靠蛋白末端6个His与Ni-NTA的金属离子进行螯合。洗脱过程首先用不含有咪唑的缓冲液洗柱，目的是洗脱未与Ni-NTA结合的细胞体杂蛋白，然后用不同浓度的咪唑（20～300 mmol/L）缓冲液进行梯度洗脱，根据蛋白质的大小与金属离子的结合牢固程度，在一定的咪唑浓度条件下，可以得到较纯的酶液。蛋白质含量采用Bradford法测定，以BSA为标准蛋白。

1.7 ALDC酶活力的测定

参照Garmyn[7]，陈卿[11]等所述的方法并加以调整。

ALDC催化α-乙酰乳酸脱羧生成乙偶姻，乙偶姻在碱性条件下可以与肌酸和α-萘酚的混合物反应生成红色的物质，在一定的范围内生成的红色物质的吸光值与乙偶姻的含量成正比，根据这一原理，来测定ALDC的活性。一个单位酶活（U）定义为:在30℃，pH 6.0的反应条件下，1 min使a-乙酰乳酸脱羧形成1 μmol乙偶姻所需的酶量。

标准曲线的测定:取溶于MES I的乙偶姻各400 μL（乙偶姻的含量分别为 5、10、15、20、25 μg），加入显色剂4.6 mL，30℃水浴30 min显色后于520 nm处测吸光值，以400 μL MES I加4.6 mL显色剂作为空白对照。绘制得到的标准曲线用于下一步酶活的计算。

酶活的测定:200 μL酶液与200 μL底物混合，在30℃水浴反应10 min加入4.6 mL显色剂30℃水浴30 min显色，520 nm处测定吸光值。

1.8 酶学性质的研究方法

1.8.1 最适pH及pH稳定性 用底物缓冲液MESⅡ配制不同 pH（3.0～11.0）的底物溶液，将酶液用MES I稀释一定倍数，然后将不同pH的底物380 μL与稀释好的酶液20 μL反应，测定不同pH条件下ALDC的活性，考察pH值对其酶促反应的影响。配制不同pH（5.0～10.0）的酶活测定缓冲液MES I，用它们来稀释酶液得到不同pH的酶液。让酶处于不同pH环境中，每隔一定时间取样，测定酶的剩余活性；反应体系为:20 μL 酶液，180 μL MES I，200 μL底物。以蒸馏水代替酶液作为空白对照，考察该酶在不同pH条件下的稳定性。

1.8.2 最适温度及温度稳定性 在10～45℃设置8个反应温度 10、15、20、25、30、35、40、45 ℃，测定不同温度条件下ALDC的酶活力，确定其最适反应温度。 将适当稀释的酶液分别在–20、0、25、35、45、55、65、75℃保温，每隔2 h取样，测定不同温度下酶的剩余活力，从而研究该酶在不同温度下的稳定性。

1.8.3 不同金属离子以及EDTA对酶活的影响分别在反应体系中加入终浓度为1 mmol/L的Ca2+、Sn2+、Ni2+、Zn2+、Li+、Mn2+、K+、Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+离子以及EDTA，以不加金属离子的反应体系为对照，研究各金属离子对ALDC酶活的影响。

1.8.4 Km值及Vmax的测定 配置不同浓度的α-乙酰乳酸底物溶液，分别进行酶促反应，反应时间控制在2 min。采用 Lineweaver-Burk作图法确定ALDC的Km及Vmax值。

1.9 重组枯草芽孢杆菌的产酶发酵培养 重组枯

草芽孢杆菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600经LB液体培养基活化后，按1%的接种量转接至50 mL发酵产酶培养基中，于37℃培养36 h，进行ALDC酶活测定。并在5 L的发酵罐上进行放大试验，装液量为2.5 L，接种量4%，转速 350 r/min，通气量 1 L/（L·min），37 ℃培养 48 h，发酵过程中跟踪检测菌体浓度、残糖含量及ALDC酶活力。

2 结果与分析

2.1 ALDC基因的克隆及表达载体的构建

提取B.subtilis L5-20全基因组DNA，用所设计的引物进行PCR扩增，得到长度为786 bp（其中包含18 bp的His编码序列）的基因片段（图1）。

将T-alsD-His用BamH I和Mlu I进行双酶切，将其与经相同酶切线性化的表达载体pMA5连接，转化至E.coli JM109感受态细胞中。获得的重组表达载体pMA5-alsD-His经BamH I和Mlu I双酶切验证（图2），得到约7 000 bp和780 bp大小的片段，分别对应线性pMA5和alsD-His的大小，表明外源基因alsD-His已经正确连接到表达载体pMA5上。

图1 alsD基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of alsD gene

图2 重组质粒pMA5-alsD-His的酶切验证Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pMA5-alsD-His by enzyme digestion

2.2 alsD基因在B.subtilis WB600中的表达及重组蛋白ALDC的纯化

将重组载体pMA5-alsD-His转化至B.subtilis WB600中，在卡那霉素抗性平板上筛选阳性重组子，即得重组菌株pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600，将其接种于LB液体培养基培养16 h，收集菌体并洗涤，菌体用MES I缓冲液悬浮，采用超声波破碎细胞，破碎上清液SDS-PAGE分析结果显示，重组蛋白相对分子质量（Mr）约为 32×103，与预期分子量大小相符，表明ALDC在B.subtilis WB600成功获得了表达。同时测定粗酶液中的蛋白含量以及酶活力，得知其中蛋白含量为91.0 mg，总酶活为3 395.0 U，比酶活为37.3 U/mg。经Ni-NTA纯化后得到较纯的酶液，测得其中蛋白含量为11.2 mg，总酶活为3 050.0 U，比酶活为272.3 U/mg，纯化后的比酶活是纯化前的7.3倍，酶活回收率为89.8%。SDS-PAGE结果（图3）看出经过纯化得到较纯的重组ALDC蛋白，纯化效果见表2。

图3 重组枯草芽孢杆菌ALDC表达与纯化的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed and purified recombinant ALDC

表2 重组蛋白ALDC纯化情况Table 2 Purification of recombinant ALDC

2.3 重组ALDC的酶学性质

2.3.1 最适pH值及pH稳定性 配置pH 3.0～11.0的反应缓冲液，分别测定不同pH下ALDC的酶活力，结果见图 4。 由图 4（a）可知，ALDC 在 pH 5.0～7.0范围内均具有较高的活力，最适pH为6.0。当pH大于7.0时酶活力迅速下降，pH 8.0和pH 9.0条件下的酶活力约为最大酶活的34%，在pH 3.0～4.0及pH 11.0条件下酶活几乎为零。

图4 α-乙酰乳酸脱羧酶的最适pH及其pH稳定性Fig.4 Optimal pH and pH stability of ALDC

将ALDC分别在pH 5.0～10.0条件下处理，测定酶活性。从图4（b）中可以看出，ALDC在pH 6.0～9.0环境中较稳定，在pH 6.0和pH 7.0条件下处理10 h后，剩余酶活仍在90%以上；在pH 8.0和pH 9.0条件下处理10 h后，剩余酶活也在70%以上。在pH 5.0与pH 10.0环境下，该酶的活性在2.5 h内迅速下降，并且在10 h后活性完全消失。表明该重组ALDC较适应中性范围的环境，对酸性及强碱性环境敏感。

2.3.2 最适温度及热稳定性 在10～45℃范围内，进行ALDC的酶促反应，结果如图5（a）所示，随着温度的升高，ALDC酶活呈上升的趋势，在25℃时达到最大值，此后开始呈下降趋势，在20～35℃范围内，ALDC显示较高的活力，最适反应温度为25℃。

将重组 ALDC 分别在-20、0、25、35、45、55、65、75℃条件下保存一定的时间后，测定酶活力大小。结果如图5（b）显示，在25℃以下，该酶非常稳定，保温10 h后剩余酶活仍有95%左右。在35℃和45℃环境下保存10 h后剩余酶活分别在60%和70%以上。55℃时保温10 h后剩余酶活力不足20%。而当温度升高到65℃时，保存4 h即接近完全失活。

图5 α-乙酰乳酸脱羧酶的最适反应温度及其热稳定性Fig.5 Optimal temperature and thermal stability of ALDC

2.3.3 金属离子以及EDTA对酶的影响 通过单独添加相同终浓度（1 mmol/L）的不同金属离子以及EDTA，研究它们对ALDC酶活力的影响，结果如表3所示。 Ni2+对 ALDC 有一定的激活作用，Ca2+、Cu2+、Mn2+、Sn2+、Zn2+、Na+、K+、Li+、EDTA 对其活性有不同程度的抑制作用，其中Ca2+的抑制作用最小，Cu2+、Mn2+、Sn2+、Zn2+次之，Na+、K+、Li+、EDTA 的抑制作用较为强烈，而Fe3+使ALDC活性完全丧失，Mg2+对ALDC既没有激活也没有抑制作用。

表3 金属离子及EDTA对ALDC的影响Table 3 Effect of ions and EDTA on ALDC

2.3.4 Km值及Vmax的测定 根据不同底物浓度与酶促反应的关系，按照米氏方程，采用Lineweaver-Burk作图法，计算得出重组ALDC的Km及Vmax值。如图 6 所示，ALDC 的Km值为 29.04 μmol/L，Vmax为2.82 mmol/（L·min）。

图6 ALDC的Lineweaver-Burk作图Fig.6 Lineweaver-Burk plot of recombinant ALDC

2.4 重组枯草芽孢杆菌ALDC的表达

将pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600接种至LB液体培养基中37℃培养16 h。经测定，胞外ALDC酶活为4.9 U/mL，胞内ALDC酶活为22.1 U/mL，总酶活为 27.0 U/mL，约为出发菌B.subtilis L5-20 ALDC总酶活的70倍。

2.5 重组枯草芽孢杆菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600的发酵产酶研究

重组枯草芽孢杆菌经LB液体培养基活化后，按1%的接种量转接至50 mL发酵产酶培养基，于37℃培养36 h，ALDC酶活测定结果显示，胞外ALDC酶活为22.6 U/mL，胞内酶活为43.2 U/mL，总酶活为65.8 U/mL。

将重组菌在5 L的发酵罐中进行放大试验，结果见图7。随着发酵的进行，菌体量在前期呈现不断上升的趋势，36 h时达到最大值，此后进入平衡期并开始缓慢下降；ALDC酶活的变化与菌体量呈现相似的趋势，在36 h达到最大，约75.9 U/mL，其中胞内、胞外ALDC酶活分别为46.6 U/mL和29.3 U/mL。

图7 重组枯草芽孢杆菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600 5 L罐发酵结果Fig.7 Fermentation results of pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600 in 5 L bioreactor

3 结语

从一株耐低温B.subtilis L5-20中克隆得到alsD基因，将其连接到表达载体pMA5上，并转化B.subtilis WB600，构建重组菌pMA5-alsD-His/B.subtilis WB600。选用Ni柱亲和层析纯化重组ALDC，纯化后比酶活达272.3 U/mg，回收率为89.8%，纯化倍数为7.3，并用所得的纯酶进行了酶学性质的研究。这是B.subtilis ALDC首次在枯草芽孢杆菌中的游离表达和纯化。

已报道的ALDC最适作用温度都在40℃左右。Rasmussen等[12]从干酪乳杆菌中纯化出的ALDC的最适温度为40℃。Ohshiro等[13]研究了乙酰短杆菌的ALDC，最适反应温度也为40℃，60℃以上迅速失活。尹东等[14]的研究显示，产气肠杆菌ALDC的适合温度为35～45℃。郑华军等[15]研究的地衣芽孢杆菌ALDC最适温度为40℃，且对热（40℃以上）敏感。作者研究获得的重组ALDC最适温度为25℃，在20～35℃范围内均表现出较高的活性，该酶显示出一定的耐低温特性，在15℃酶活力还保留在最高活力的70%左右，10℃时酶活力仍保留在最高活力40%以上，这一优异的特性使它更加适合啤酒生产的条件，极大地提高了酶的催化效率，降低了生产成本。

本研究小组前期将B.subtilis L5-20的alsD基因在大肠杆菌中表达，ALDC酶活为10.3 U/mL，虽然酶活比之前的报道有较大提高，但利用大肠杆菌表达系统表达来源于枯草芽孢杆菌的ALDC效果并不理想。且考虑到大肠杆菌属于潜在致病菌，不适用于食品添加剂用酶的工业化应用；并且目前利用大肠杆菌表达系统表达的蛋白质多为胞内表达，后期提取工艺较复杂，因此从安全性和操作成本上分析，选择一种高效胞外表达枯草芽孢杆菌基因的宿主是非常必要的。ALDC作为食品工业酶制剂，对其安全无毒害的要求较为严格，而枯草芽孢杆菌有长期制备发酵食品的历史，不产内毒素和致热敏蛋白质，是一种公认安全的微生物，无论是作为出发菌还是宿主菌都具有很强的可行性。虽然原始菌B.subtilis L5-20具有ALDC活性，但是其表达量对于工业酶制剂生产来说还远远不够。鉴于以上因素，作者采用基因工程手段，选择枯草芽孢杆菌作为表达的宿主菌，将alsD基因在B.subtilis WB600中获得高效表达，重组菌经LB培养后ALDC酶活达27.0 U/mL，约为出发菌酶活的70倍。而经发酵培养基培养，ALDC酶活高达65.8 U/mL，再经5 L的发酵罐放大试验，ALDC酶活达75.9 U/mL（其中胞内胞外ALDC酶活分别为46.6 U/mL和29.3 U/mL），较出发菌得到了极大地提升，较先前在大肠杆菌中表达的酶活也提高了很多，与已报道的重组菌酶活相比有很大的优势，该重组菌具有很好的开发潜力。

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