传统鱼露发酵液中优势乳酸菌的分离、纯化与初步鉴定

张 豪，章超桦，曹文红，李瑞杰

（广东省水产品加工与安全重点实验室，广东普通高等学校水产品深加工重点实验室，广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

鱼露（fish sauce）亦称鱼酱油，其营养丰富，味道鲜美，是我国东南沿海、日本以及东南亚一带的传统调味料，在国内又以潮汕鱼露最为典型[1]。传统的鱼露生产是盐渍和发酵两者相结合的产物，即利用盐渍抑制腐败微生物，通过鱼体自身的蛋白酶以及微生物的共同作用进行水解的过程，从而达到生产鱼露的目的[2]。众所周知，鱼露在前期盐渍自溶的基础上，通过中后期长期的陈化，慢慢形成鱼露所特有的风味。乳酸菌作为鱼露中后期发酵的优势菌，其变化与鱼露的各项理化指标及游离氨基酸的变化有着密切的联系，并对鱼露风味的形成有着积极的贡献[3-5]。而目前对鱼露中后期风味形成有着密切联系的优势菌——乳酸菌研究还比较少。

本实验旨在通过对后期发酵液的不同阶段（12、15、18、21、24个月）中乳酸菌的分离鉴定，从而获得贯穿整个发酵中后期的优势菌种，并研究其生化特性及酶活性。以期对中后期乳酸菌种类、特性有一定的了解，为进一步探究乳酸菌对鱼露风味的影响提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

传统鱼露发酵样品 发酵周期为两年，以蓝圆鲹为原料，与一定比例的海盐混合，在（30±5）℃下分别已自然发酵12、15、18、21、24个月，由广东省汕头鱼露厂有限公司提供；分离培养基、MC固体培养基、MRS固体培养基、明胶液化培养基、吲哚实验培养基、H2S产生实验、硝酸盐还原实验的培养基、糖醇类碳源发酵管 北京陆桥技术有限责任公司；NaCl等试剂 均为分析纯，广州化学试剂公司。

表1 5个分离菌株的形态特征Table1 Characteristics of five isolated strains

01J2003-04立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司；sky-1102C恒温培养摇床 上海苏坤实业有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SLI-700恒温培养箱 上海爱朗仪器有限公司；PHS-2pH计 上海精科；UX2200H电子天平 SHIMADZU CORPORATION JAPAN；L1100双目微生物显微镜 广州市广精精密仪器有限公司；岛津UV-2550紫外可见分光光度计日本岛津公司。

1.2 实验方法[6-7]

1.2.1 发酵液样品的采集 传统鱼露发酵过程是一个开放的环境，因此，在取样时，要尽量避免外界空气杂菌的影响，所取不同阶段的发酵液均为距其上表面8～12cm处的样品。

1.2.2 乳酸菌的分离 在MC固体培养基中，选取具有明显数量优势的菌株划线分离，直到得到纯菌株。纯化后的菌株分别接种到MRS斜面培养基，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.3 乳酸菌的鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定 将分离纯化后的菌株涂布到MRS固体培养基上，（35±0.2）℃下培养48h，观察菌落特征，取典型菌落进行革兰氏染色，并在油镜下观察菌体形态。

1.2.3.2 生理生化实验 对分离后的菌株进行接触氧化酶实验、产H2S实验、明胶液化实验、硝酸盐还原实验、葡萄糖产气实验；用半固体培养基测定菌株的运动性。

1.2.3.3 糖醇类发酵实验 通过菌株的糖醇类发酵实验，检验分离菌株对各种糖醇类碳源的利用情况。

1.2.3.4 耐盐实验 将分离菌株接种于MRS肉汤培养基中，（35±0.2）℃下培养24h。吸取一定量菌株培养液接种到NaCl含量（质量分数）为0、3%、6%、9%、12%的MRS肉汤培养基中，（35±0.2）℃下培养48h，于650nm下测定OD值。

1.2.4 蛋白酶和脂肪酶活性实验 采用添加10%脱脂乳的MRS固体培养基，分别滴入0.2m L的菌液涂布均匀，（35±0.2）℃培养48h。若有透明圈出现，则可判定该菌株有分解蛋白质的能力。采用添加10%猪油和中性红指示剂的MRS固体培养基，分别滴入0.2m L的菌液涂布均匀，（35±0.2）℃培养48h。若有红色斑点出现，则可判定该菌株有分解脂肪的能力。

1.2.5 优势乳酸菌24h的生长曲线及产酸能力的测定 在MRS肉汤培养基中，分别接入经活化过的分离菌株，在（35±0.2）℃下振荡培养，用分光光度计于波长650nm处每隔4h测定其吸光度值（OD值），连续测定24h，以不接种的MRS肉汤培养基作为对照，并同时对应测定其24h内的pH的变化情况。

2 结果与讨论

2.1 中后期鱼露发酵液中不同阶段乳酸菌的分离鉴定

通过对两年制鱼露发酵液中后期不同阶段乳酸菌的分离与鉴定，共分离获得28种乳酸菌，其中有5种优势乳酸菌贯穿整个鱼露发酵的中后期，分别编号为R1、R2、R3、R4、R5，其形态特征及菌体特征见表1与图1。

图1 5个分离菌株的菌体形态（1000×）Fig.1 Cellmorphology of five isolated strains（1000×）

由表1、图1可以看出，中后期鱼露发酵液中的优势乳酸菌多数为白色，菌落表面湿润、光滑，边缘整齐，均为革兰氏阳性菌；个体形态不尽相同，杆状、假分枝状和球状。

2.2 乳酸菌的生理生化鉴定结果

乳酸菌的生理生化反应与糖醇类发酵实验结果分别见表2和表3。5种乳酸菌的接触酶实验均为阴性，不运动，不产H2S和吲哚，不液化明胶，可利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖和半乳糖。5种菌株都不能利用鼠李糖和山梨糖。相比较而言，R1、R4的耐盐性要强于R2、R3、R5。

根据菌体和菌落形态、生理生化实验及糖醇类发酵实验结果，对照《乳酸菌——生物学基础及应用》[8]、《乳酸菌分类鉴定及实验方法》[9]和《伯杰细菌鉴定手册》[10]对菌株进行鉴定分析。鉴定结果为：R1为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、R2为德氏乳杆菌乳亚种（L.delbrueckii subsp.lactis）、R4为短乳杆菌（L.brevis）、R5为乳酸乳球菌乳亚种（L.lactis subsp.lactis），而R3未能鉴别出种属。

表2 5个分离菌株的生化特性Table2 Biochemistry characters of five isolated strains

表3 糖醇发酵实验结果Table3 Fermentation results of sugar and alcohol

2.3 乳酸菌对蛋白质和脂肪能力的测定

表4 蛋白质和脂肪降解活性Table4 Degradation activity of protein and fat

实验中对分离的5株乳酸菌对蛋白质和脂肪的降解活性进行了分析，其结果见表4。鱼露发酵的中后期是其风味形成的关键时期，发酵液中的乳酸菌如果具有蛋白质酶和脂肪酶活性，则可能引起腐败、出现酸败味等现象[11-12]。从表4可知，所分离的R1、R2、R3、R4、R5均不具有蛋白质酶活性和脂肪酶活性。

2.4 乳酸菌24h生长曲线及产酸能力的测定

由图2可以看出，所分离的5种菌株在4h以后OD值明显升高，进入对数生长期，在培养16h后，OD值均达到较高水平，此后变化幅度趋于平稳，说明菌种已进入生长稳定期。乳酸菌在发酵液中产生大量的乳酸、乙酸等，提高了酸度，从而抑制其他杂菌的生长，并能促进鲁氏酵母等一些增香酵母菌的繁殖和发酵[13-14]，从而与酵母菌共同作用，形成鱼露特有的风味。同时，产酸能力的大小也是衡量乳酸菌能否作为发酵剂的重要指标之一。由图3可见，5株乳酸菌分别在MRS肉汤培养基中的整体pH都呈下降趋势，期间前4h下降较缓慢，此后，菌液的pH急剧下降，16h后pH变化较小。相对而言，R3、R5的产酸能力较强，在培养24h后的pH为4.0左右。而R1、R4的产酸能力较弱，在培养24h后的pH为4.5左右。

图2 菌液OD值随时间变化曲线Fig.2 Changes in OD value of culturewith time

图3 菌液pH随培养时间变化曲线Fig.3 Changes in pH of culturewith time

3 结论

以发酵周期为两年的传统鱼露发酵液为研究对象，分别对中后期不同阶段（12、15、18、21、24个月）发酵液中的乳酸菌进行筛选。共分离获得28种乳酸菌，其中至少有5种优势乳酸菌贯穿整个发酵的中后期，分别是R1为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）、R2为德氏乳杆菌乳亚种（L.delbrueckii subsp.lactis）、R4为短乳杆菌（L.brevis）、R5为乳酸乳球菌乳亚种（L.lactis subsp.lactis），R3未能鉴别出种属。其中R1、R4的耐盐性比较强，而R3、R5的产酸能力则相对较强。这5株乳酸菌均不具有对蛋白质和脂肪的降解能力。该结果进一步加深了对鱼露发酵过程中乳酸菌种类、性质的了解，为下一步探讨多菌种发酵鱼露提供了一定的理论基础。

[1]朱志伟，曾庆孝，阮征，等.鱼酱油及加工技术研究进展[J].食品与发酵工业，2006，32（5）：96-100.

[2]章超桦.水产食品学[M].第二版.北京：中国农业出版社，2010：301-302.

[3]黄紫燕，朱志伟，曾庆孝，等.传统鱼露发酵的微生物动态分析[J].食品与发酵工业，2010，36（7）：18-22.

[4]L opetcharat K，Y eung JChoi，Jae W Park，et al.Fish sauce productes and manufacturing：a review[J].Food Reviews International，2001，17（1）：65-88.

[5]江津津，曾庆孝，朱志伟，等.耐盐微生物对鯷制鱼露风味形成的影响[J].食品与发酵工业，2008，34（11）：25-28.

[6]东秀珠，蔡妙英.常见细菌鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：370-378.

[7]林伟涛，徐世明，吕加森，等.中式发酵干肠中乳酸菌的分离筛选、鉴定和培养[J].食品工业科技，2010，31（1）：194-197.

[8]杨洁斌，郭兴华，凌代文.乳酸菌——生物学基础及应用[M].北京：中国轻工业出版社，1991：1-31.

[9]凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999：6-27.

[10]Budanan R E，Gibbonr N E.伯杰细菌鉴定手册[M].北京：中国科学出版社，1984：660-797.

[11]赵俊仁，孔保华.自然发酵风干肠中乳酸菌的分离与鉴定[J].食品工业科技，2010，11（31）：158-160.

[12]Emanuela Z，Sergio G，Alessandra，et al.Lipolysis and lipid oxidation in fermented sausages depending on differentprocessing conditions and different antioxidants[J].Meat Science，2004，66：415-423.

[13]松本伊左尾.乳酸菌和酵母菌的添加时期及添加量对酱醪发酵的影响[J].中国调味品，1989（7）：27-31.

[14]严留俊.改善酱油风味的微生物及工艺研究[D].无锡：江南大学，2008：8-10.