新型核酸染料在甜菜分子实验琼脂糖电泳中的应用

吴则东，徐艳丽，王华忠

（1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学,哈尔滨150080；2.中国农业科学院甜菜研究所/黑龙江大学农作物研究院,哈尔滨150080；3.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室,哈尔滨150080；4.新疆博乐市农业技术推广中心,博乐833400）

新型核酸染料在甜菜分子实验琼脂糖电泳中的应用

吴则东1,2,3，徐艳丽4，王华忠1,2,3

（1.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江大学,哈尔滨150080；2.中国农业科学院甜菜研究所/黑龙江大学农作物研究院,哈尔滨150080；3.中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室,哈尔滨150080；4.新疆博乐市农业技术推广中心,博乐833400）

通过对两种核酸染料Goldview（GV）和EB(溴化乙锭)对甜菜基因组DNA及Lambda DNA的染色效果进行比较研究，发现两种染料染色效果相当，清晰度相差不大，均可有效鉴别20ng以上的DNA样品，证实新型核酸染料Goldview完全可以代替强毒性的EB，用于甜菜基因组以及某些PCR产物的检测。

甜菜基因组；溴化乙锭；Goldview

随着分子生物学的发展,很多相关的实验室每天都在进行着DNA提取以及检测的工作,而核酸染料则是不可缺少的试剂。目前大多数实验室所使用的核酸染料都是EB。EB具有操作快速,在低浓度的条件下,在紫外光下至少可以检出1～10ng的DNA条带,从而可以确定凝胶中DNA片段的位置[1]。虽然EB具有以上很多优点,目前仍是国内大多数实验室首选的药品,但EB具有致癌作用,操作时要戴上手套,操作不当极易造成伤害及对环境的污染[2]。近年来,有多种EB的替代品问世,例如SYBR Green I[3-4]就是一种高灵敏度且不具有强致突变性的核酸染料,国外一些实验室已经在使用,国内也有些实验室利用SYBR Green I取代EB,可以检测出20pg的DNA,比EB灵敏20～100倍,但其价格过于昂贵,对于实验室每天都要用到的必需品,很多实验室难以承受。因此我们选择了一种价格便宜、使用方法与EB相同,且不具致癌性的新型核酸染料GV进行实验,验证其在甜菜分子生物学实验中代替EB的可能性。

1 材料和方法

1.1材料和试剂

1.1.1 实验材料实验中所用的甜菜品种为甜研310、ZD204、ZD210、内28128和甜单305（分别编号为1、2、3、4、5）,所有品种由黑龙江大学农作物研究院和内蒙古农牧业科学院提供。

1.1.2 实验试剂GV染料、EB、琼脂糖等购自哈尔滨晶美生物公司,Lambda DNA购自上海生工,其余试剂为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器DYCZ-30型电泳槽（北京六一仪器厂）,伯乐公司的凝胶成像仪,伯乐的电泳仪,JY-SPA水平电泳槽,国产真空冷冻干燥机。

1.2实验方法

1.2.1 DNA的提取采用SDS法[5]提取甜菜基因组DNA,略有改动,利用真空冷冻干燥机将3份甜菜材料的叶片转化为干粉,每份干粉称取30mg。加入SDS提取液,65℃水浴40min。冷却至室温后,13000r/min离心8min,取上清。加入等体积氯仿：异戊醇（24∶1）,混匀,13000r/min离心8min,取上清。加入等体积的异丙醇,混匀,12000r/min离心8min,去上清。用适量预冷70%乙醇清洗沉淀2次。将沉淀干燥后溶于200μL灭菌的双蒸水,-20℃保存备用。

1.2.2 1%琼脂糖制备称取0.5g琼脂糖置于三角瓶内,加入50mL 0.5×TBE缓冲液,利用微波炉加热使其溶化,轻轻混匀,冷却至室温,以手摸不烫为准,加入20000×GV染料2μL,轻轻混匀倒乳制胶槽。EB的琼脂糖制备与此相同,只是50mL凝胶中加入10mg/mL的EB为5μL。

1.2.3 Lambda DNA及甜菜基因组检测6μL体系中分别含有100ng、90ng、80ng和10ng的Lambda DNA及1μL的上样缓冲液（0.25%的溴酚蓝及40%的蔗糖）；6μL体系中含有2μL的甜菜基因组DNA,1μL的上样缓冲液,3μL的双蒸水。分别用含有EB及GV的1%琼脂糖进行检测。

2 结果分析

2.1不同染料对不同浓度的Lambda DNA检测

利用1%琼脂糖电泳分别对不同浓度的Lambda DNA使用EB及GV进行染色,检测结果见图1,从图中我们可以看出,两种染料均能够辨别出10ng以上的DNA,其中10ng的Lambda DNA亮度均较弱。

2.2不同染料对甜菜基因组DNA的检测

利用1%琼脂糖电泳分别对5个不同的甜菜品种采用EB及GV进行检测,结果见图1,从从中我们看出,两者检测的甜菜基因组DNA亮度差异不大,从图中我们也可以看出只是颜色对比度不同,但不影响染色结果。

图1 不同染料DNA琼脂糖电泳效果

3 结论与讨论

由于DNA的提取以及RAPD[6]、SSR[7]、ISSR[8]等很多分子标记都要用到琼脂糖凝胶电泳,利用凝胶成像系统进行拍照,因此不可避免地要用到染料对DNA进行定位,而目前广泛使用的就是EB。由于EB的毒性较大,而且难于降解,净化处理一般要采用KMnO4-HCl-NaOH和活性炭吸附-滤纸过滤等复杂方法[1]。而国内很多的分子实验室都采取集中回收,对EB等有毒实验室废物进行集中处理。但仍有一部分实验室把EB等有毒物质直接按照生活垃圾处理,极大地污染了环境。由于EB具有受热挥发以及难降解性,所以EB在使用过程中,如果不小心也会对实验人员造成伤害。从本实验的结果来看,GV的染色效果和EB相比较差异不大,均可对10ng以上的DNA进行染色,灵敏度都很高,因此建议在甜菜分子生物学实验中使用GV代替EB。

虽然GV具有很多优点,但在使用中应当注意以下几点：（1）GV的稳定性不如EB,放在冰箱的保鲜层保存；（2）胶太厚会影响检测的灵敏度,最好不超过5cm；（3）GV对缓冲液的要求较高,最好每次都更换缓冲液；（4）虽然GV没有明显的致癌性,但作为一种化学试剂,在使用中也要戴上手套,避免和皮肤直接接触。

[1]萨姆布鲁J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T（黄培堂译）.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社,1998.

[2]崔成德,王克林,李涢,等.Genefinder和EB在DNA电泳谱带定量分析中的比较[J].安徽农业科学,2008,36(2)：452-453.

[3]Simpson DAC,Feeney S,Boyle C,et al.Technical Brief：Retinal VEGF mRNA Measured by SYBR Green I Fluorescence：A Versatile Approach to Quantitative PCR[J].Mol Vis.,2000,6：178-183.

[4]Zipper H,Brunner H,Bernhagen J,et al.Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I,its structure determination and methodological implications[J].Nucleic acids research,2004,32(12)：e103.

[5]侯静,马凤鸣,陈胜勇,等.甜菜基因组DNA的提取及Southern杂交分析[J].东北农业大学学报,2008,39(12)：14-18.

[6]赵培,王振英,彭永康.琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术检测小麦基因组DNA RAPD扩增产物的方法学比较[J].中国生物工程杂志,2003,23(8)：96-100.

[7]李勇,牛永春.基于琼脂糖凝胶电泳的小麦SSR扩增体系优化[J].华北农学报,2009,24(6)：174-177.

[8]王海飞,关建平,马钰,等.中国蚕豆种质资源ISSR标记遗传多样性分析[J].作物学报,2011,37(4)：595-602.

Application of Novel Nucleic Acid Dye in Agarose Electrophoresis in Sugarbeet Molecular Experiments

WU Ze-dong1,2,3,XU Yan-li4,WANG Hua-zhong1,2,3
（1.Key Laboratory of Sugarbeet Genetics&Breeding,Heilongjiang University,Harbin 150080,China；2.Sugarbeet Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Crop Research Institute of Heilongjiang University,Harbin 150080,China;3.Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080,China;4.Extension Station of Agricultural Techniques of Bole City,Bole,Xinjiang 833400,China）

The feasibility of nucleic acid dyes Goldview(GV)and ethidium bromide(EB)to dye sugarbeet genomic DNA and Lambda DNA were compared.The results of both dyes were similar,enabling to effectively identify samples of more than 20 ng DNA.This suggests on the novel nucleic acid dye GV to substitute carcinogenic EB to detectgenomic DNA of sugarbeet.

beet genome;ethidium bromide;Goldview

S566.301；Q78

：A

1007-2624（2013）02-0015-02

2012-10-31

甜菜现代产业技术体系建设“甜菜丰产抗病种质创新及新品种选育”(CARS-210104-01)。

吴则东（1972-）,男,黑龙江省依兰县人,助理研究员,中国农业科学院研究生院在读博士,主要从事甜菜遗传及分子育种的研究。E-mail：331056376@qq.com

王华忠（1957-）,男,辽宁省西丰县人,研究员,博士生导师,从事甜菜遗传育种研究。Tel：0451-86609494,E-mail: wwhhzz0451@sohu.com