山银花不同物候期总皂苷的含量测定

高立新(濮阳市油田总医院，河南 濮阳 457001)

山银花不同物候期总皂苷的含量测定

高立新(濮阳市油田总医院，河南 濮阳 457001)

目的 建立山银花药材中总皂苷含量测定方法。方法 采用分光光度法，以香草醛-高氯酸为显色剂，在477 nm处测定不同物候期山银花药材中总皂苷的含量。结果 灰毡毛忍冬皂苷乙在0.501～6.012 μg·mL-1内呈良好的线性关系，平均加样回收率为100.1%。山银花花蕾不同发育期样品中总皂苷含量差异明显，以灰毡毛忍冬皂苷乙计，总皂苷含量在8.00%～21.41%内均有分布。结论 山银花整个花期皂苷类成分差异明显，其中银花期含量最高，米蕾期最低。本实验为山银花药材的采收加工提供了数据支撑。

山银花；总皂苷；灰毡毛忍冬皂苷乙；比色法

山银花Lonicerae Flos为忍冬科植物灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand-Mazz.)、红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq.)、华南忍冬(Lonicera Confuse DC.)或黄褐毛忍冬(Lonicera fulvotomentosa Hsu et S. C. Cheng.)的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、疏散风热之功效，用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热等[1-2]。2010年版中国药典将山银花与金银花分列，并在药材质量标准项下收载了以绿原酸[3]、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙为评价指标的定量分析方法。关于金银花花蕾在不同发育期有效成分动态变化多有报道[4-7]，山银花花蕾在不同发育期的研究相对较少。本研究以总皂苷为指标，比较山银花花蕾不同发育期皂苷含量的差异。

1 仪器与试药

对照品灰毡毛忍冬皂苷乙(自制，HPLC面积归一化法纯度≥98%，经波谱分析鉴定结构)。

山银花样品采自湖南，经河南中医学院代丽萍副教授鉴定为忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand-Mazz.的干燥花蕾或带初开的花。

T6新世纪紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；Sartorius型电子天平(德国赛多利斯)；KQ-100E型超声波清洗器(昆山超声仪器科技有限公司)；所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 最大吸收波长的确定

准确移取0.1 mL灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液、50 μL山银花甲醇提取液，分别置于10 mL具塞试管中，挥干溶剂，加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，再加入高氯酸0.6 mL，密塞、摇匀，于65 ℃水浴中加热20 min，立即取出用流水冷却至室温，加入冰醋酸5 mL稀释，摇匀。350～800 nm内进行全波长扫描，以不加对照品和供试品的样品管为空白。对照品和供试品溶液在477 nm处均有最大吸收，确定山银花中总皂苷的测定波长为477 nm。

2.2 对照品溶液的制备

取对照品灰毡毛忍冬皂苷乙适量，甲醇溶解并定容，得浓度为0.501 mg·mL-1的灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

称取干燥的山银花样品粉末(过四号筛)约0.1 g，精密称定，置入锥形瓶中，加入甲醇25 mL，超声处理45 min，冷却至室温，甲醇补充损失的重量，过滤，取续滤液50 μL，置于10 mL具塞试管中， 按“2.1”项下方法进行显色，测定吸光度。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2”项下对照品溶液10，20，40，60，90，120 μL，置10 mL具塞试管中，以试剂溶液作为参比，按“2.1”项下显色条件操作，在477 nm处分别测定吸收值(A)，以吸收值为纵坐标，含量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y= 0.183 8X+0.019，r=0.998，结果表明灰毡毛忍冬皂苷乙在0.501～6.012 μg·mL-1内线性关系良好。

2.5 仪器精密度试验

精密吸取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液30 μL，共5份，分别置于10 mL具塞试管中，按上述显色条件操作，测定吸光度，其RSD为0.33 %。

2.6 重复性试验

称取干燥的山银花粉末约1 g，共6份，精密称定，以试剂溶液作为参比，按“2.3”项下方法提取，按“2.1”项下方法测定吸光度，计算含量，以灰毡毛忍冬皂苷乙计，总皂苷平均含量为8.92 %，RSD为2.01 %。

2.7 稳定性试验

取干燥的山银花粉末约1 g，精密称定，按“2.3”项下方法提取、显色，分别于显色后0，1，2，3，4 h测定吸光度，RSD为0.60%，表明处理后的样品在显色后4 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

称量已知含量的山银花样品约0.05 g，共9份，精密称定，分别加入浓度为0.501 mg·mL-1灰毡毛忍冬皂苷乙对照品溶液适量(浓度为样品浓度的80%、100%、120%)，按“2.3”项下方法提取，按“2.1”项下方法显色，测定吸光度，计算加样回收率为100.1%，RSD为1.14%。结果见表1。

表1 灰毡毛忍冬皂苷乙加样回收率Tab 1 The recoveries of macranthoidin B

2.9 样品测定

称取各样品粉末(过四号筛)约1 g，精密称定，按“2.3”项下方法提取，测定吸光度，以灰毡毛忍冬皂苷乙计，计算各样品中总皂苷含量。结果见表2。

表2 不同发育期山银花样品中总皂苷的含量Tab 2 The contents of total triterpenoid saponin in Lonicerae Flos at different developmental stages

3 讨论

本实验建立了山银花药材中总皂苷的含量测定方法，并测定了6个不同发育期山银花样品中总皂苷的含量。结果表明山银花花蕾不同发育期样品中总皂苷含量差异显著，以灰毡毛忍冬皂苷乙计，总皂苷含量在8.00%～21.41%内均有分布，其中银花期含量最高，米蕾期含量最低。不同年份采集的山银花样品相比，总皂苷含量略有差异，但6个发育期的变化趋势一致。

在供试品溶液制备方法考察过程中，曾考察总皂苷在提取过程中是否需要石油醚脱色脱脂，结果表明，石油醚萃取对总皂苷测定结果没有显著影响；而用水饱和的正丁醇萃取富集总皂苷时，总皂苷损失较大，并且乳化严重，因此，选择溶剂超声提取后提取液直接进行显色反应，并对提取溶剂、超声时间、溶剂用量等进行单因素考察，甲醇与乙醇相比，甲醇提取效果较好；超声30，45，60 min的比较结果表明，45，60 min相当，均优于30 min的提取效果；溶剂用量分别考察了20倍、25倍和30倍体积，25倍体积时提取率最高。因此，最终确定山银花药材中总皂苷的提取工艺为甲醇25 mL，超声提取45 min。

采用比色法测定总皂苷时常用的显色剂有香草醛-高氯酸、茴香醛-浓硫酸和对二甲氨基苯甲醛等，实验曾初步比较了三者对于山银花中总皂苷显色的稳定性，对二甲氨基苯甲醛存在试剂空白颜色较深，可能干扰测定结果的情况；香草醛-高氯酸和茴香醛-浓硫酸体系颜色较浅，但显色后稳定性均不持久；参考文献中香草醛-高氯酸为最常用的显色体系，因此，本实验最终选择了香草醛-高氯酸作为显色剂，并采用正交试验对加热温度，高氯酸用量，加热时间和香草醛-冰醋酸浓度等显色条件进行了优选，最后选择加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸，0.8 mL高氯酸于65 ℃反应20 min作为显色条件；根据稳定性实验的结果，限定样品在显色后4 h内测定完毕。

REFERENCES

[1] Ch.P(2010)Vol I (中国药典2010年版. 一部) [S]. 2010: 28.

[2] LI R, ZHOU Y S, KUANG S Y, et al. Study on the anti-atherosclerosis effect of Lonicera macranthoides Hand Mazz. extract [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2011,28(2):92-94

[3] HUANG X Z, WANG Z P, TAN Z Y. Identification and determination of Lonicerae Flos cultivated varieties inGuangxi [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2013, 30(4): 395-398.

[4] XU Y C, ZHOU L Y, ZHANG J H. Phenological analysis upon yield and quality of Lonicerae Flos [J]. J Chin Med Mater(中药材), 2002, 25(8): 539-541.

[5] XU G J, SUI J T. The optimal collection season of Lonicerae Flos determined by HPLC [J]. Heilongjiang Med J(黑龙江医学), 2002, 26(11): 866.

[6] ZHANG X H, LIU J J, LIU F L. A comparison investigation on the honeysuckles of different periods [J]. Res Pract Chin Med(现代中药研究与实践), 2003, 17(3): 13-14.

[7] LIU Y G, LU J Q, GAO X Y, et al. Phenolic components and their contents in Lonicerae Flos of different periods by HPLC-MSnanalysis [J]. Pharm West China(西部药学), 2006, 3(3): 175-176.

Determination of Total Tritorpenoid Saponin in Different Buds Stages of Lonicerae Flos

GAO Lixin
(Puyang City Oil Field General Hospital, Puyang 457001, China)

OBJECTIVE To establish the determination method of total triterpenoid saponins in Lonicerae Flos. METHODS The colorimetric method was used with vanillin-perchloric acid as the chromogenic reagent. The detection wavelength was set at 477 nm. RESULTS The linear range of macranthoidin B was 0.501-6.012 μg·mL-1and the average recovery was 100.1%. The contents of total triterpenoid saponin in the samples collected from the different stages of the buds of L. macranthoides were various and fluctuated from 8.00%-21.41%. CONCLUSION The obvious difference of the total content of triterpenoid saponin is observed in six development stages of the whole flower season of L. macranthoides. The content of total teripenoid saponin in the silver phase is highest and the bud phase is lowest. The present investigation provides the scientific evidences for the optimal selection of collection and process of Lonicerae Flos.

Lonicerae Flos; total triterpenoid saponin; macranthoidin B; colorimetric method

R284.2

B

1007-7693(2013)10-1110-04

2012-11-05

高立新，男，副主任药师 Tel: 13903931878 E-mail: zgyyglx@163.com