桑叶及桑叶茶中脱氧野尻霉素及其影响因素的研究进展

肖 洪，罗金凤，黄先智，丁晓雯，*，任美燕，曾艺涛，秦樱瑞，杨 娟

（1.西南大学食品科学学院，重庆市农产品加工重点实验室，重庆400715；2.西南大学生物技术学院，重庆400715）

桑叶为桑科植物桑的叶，中医又名“铁扇子”，桑叶在中国的传统医学中可用以治疗消渴症，医书《本草纲目》、《神农本草经》中均有相关记载，是重要的医疗药物和保健食品原料。桑叶茶是由桑叶加工制作而成的新型茶品，其中桑叶绿茶甘醇香甜；桑叶乌龙茶爽口醇和，有淡淡的花香；桑红茶甘甜醇厚，有近似香蕉的果香味[1]。桑叶茶及其原料桑叶中含有丰富的DNJ，而普通的茶叶中却不含DNJ。DNJ赋予了桑叶和桑叶茶降血糖[2]、降血脂[3]、抗肿瘤[4]、抗病毒[5]等重要保健作用。本文综合了影响桑叶和桑叶茶保健成分脱氧野尻霉素含量的因素，DNJ的保健作用，以及桑叶中DNJ的分离、纯化、测定方法，为合理开发桑叶资源和DNJ提供参考。

1 桑叶及桑叶茶主要的成分和优势

桑叶营养成分丰富，每100g干物质中含粗蛋白15.3～30.9g、粗脂肪2.1～7.9g、碳水化合物9.7～39.7g、膳食纤维27.6～43.6g[6]。而桑叶茶中富含Zn、Mg、Ca、K、Mn、Cu等矿物元素，桑叶茶的矿物元素含量及比例明显优于茶叶，其中K、Ca、Mg含量较高分别为2.9、1.1、0.5g/100g，比茶叶高出3～6倍；桑叶茶中总糖（4.7g/100g）、酚类物质（5.1g/100g）、氨基酸（3.5g/100g）含量较大；同时桑叶叶面较薄水浸出物较多，比茶叶易溶解出有效成分，更有利于人体的吸收[7]。此外桑叶和桑叶茶中还含有γ-氨基丁酸（32.5～122.4mg/100g湿重）[8-9]、褪黑激素（279.6～384.4ng/g干重）[10]、黄酮苷[11-12]、α-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制剂[13]，以及生物碱、茶多酚，花青素、绿原酸、白藜芦醇、氧化芪三酚、β-胡萝卜素等生物活性成分[14-15]。

2 影响脱氧野尻霉素（DNJ）含量的因素和DNJ的保健功能

2.1 影响DNJ含量的因素

2.1.1 桑树品种和产地 对泰国的35个桑树品种研究发现，桑嫩叶中DNJ含量为30～170mg/100g干重，Kam、Burirum 60 和Burirum 51中DNJ含量较高，其中Burirum 60嫩芽中DNJ含量高达300mg/100g干重[2]。Meng等也研究发现中国不同产地的桑叶中DNJ含量差异显著，其中海南的琼41和陕西的猪桑DNJ的含量最高，分别为0.344%和0.309%，而江苏的湖桑32号（0.08%）和新疆的疏勒白桑（0.086%）DNJ含量比较少，而来自同一地区的不同品种桑叶中DNJ含量也有差异，如其中均来自四川省的桑叶品种DNJ含量最高达0.256%，最低仅为0.111%[16]。

2.1.2 季节 桑叶中的DNJ含量与季节相关，在5月桑叶中DNJ平均含量0.052%±0.029%（n=82），7月桑叶中DNJ平均含量为0.063%±0.029%（n=83），8月平均含量为0.071%±0.037%（n=82）；在5月大多样品中DNJ含量在0.04%～0.06%，所有样品中DNJ含量没有超过0.14%，7月大多样品中DNJ含量集中在0.02%～0.04%，3种样品中DNJ含量超过0.14%，但在8月大多样品中DNJ含量0.06%～0.08%，4种样品中DNJ含量超过0.14%，因此8月采摘桑叶可以获得较高含量的DNJ[17]。

2.1.3 施氮量和氮元素形态 YIN Hao等[18]研究了施氮量及氮元素形态（NO3-和NH4+）对桑叶中DNJ含量的影响，发现两种氮肥（NH4+-N和NO3--N）的加入，随着施氮量的增加，桑叶中的DNJ含量先增加后降低，这可能是因为以氮为基础的次生代谢物质（如生物碱、DNJ等含氮化合物）与植物体内C/N比呈负相关；与NH4+-N对比NO3--N更有利于桑叶中DNJ的积累；当NH4+-N∶NO3--N=25∶75时，桑叶中的DNJ含量达到最高，因此氮形式和氮含量会对桑叶中DNJ的含量有影响。

2.1.4 光照强度 殷浩等[19]研究了光照强度对桑叶中DNJ含量的影响，发现遮阴处理能显著增加桑苗叶的DNJ含量，当遮阴程度增加时，DNJ含量明显增加；桑苗叶片在25%光强下处理5d，桑苗叶片中DNJ含量最高可达0.2043%；在处理15d时，桑叶中DNJ含量比100%光强下增加幅度大，高达60.63%；而遮阴5d后，继续遮阴却对桑叶中DNJ含量基本没有影响。

2.1.5 金属元素和维生素 研究发现，采用MS培养基，适当提高果糖和无机盐浓度，降低磷酸盐浓度等，有利于桑苗叶片中DNJ的合成和积累；培养基中的Fe2+浓度对桑苗叶片中DNJ的含量有显著影响，无Fe2+时不能合成DNJ，Fe2+浓度在0.05～0.20mmol/L范围内，DNJ的含量随着Fe2+浓度增加有所降低，培养基中的烟酸、维生素B6对于桑苗叶片中DNJ的合成具有抑制作用，而Mg2+、肌醇、维生素B1和甘氨酸等对DNJ合成影响较为复杂，有一定的互作效应[20]。

2.1.6 其他因素 LOU等[21]研究了DNJ含量与地理位置、土壤特性、气象因素和收获时间等因素之间的关系，发现它们分别是桑芽从树枝的顶端部分的DNJ的含量最高，其次是根，幼叶和成熟叶；桑树成长与高纬度地区的DNJ的含量较高；碱性和低氮总含量土壤是有利于DNJ的合成；而DNJ合成高峰期为每天的06∶00至10∶00时和下午18∶00。

2.2 DNJ的保健功能

2.2.1 降血糖 桑叶茶中DNJ可以抑制α-葡萄糖苷酶活性，DNJ能同小肠中的麦芽糖酶、蔗糖酶和乳糖酶等2-糖苷酶结合，阻止了二糖分解为单糖被消化吸收，从而明显地抑制了餐后血糖值急剧升高。通过对自愿者的研究，发现一次性口服0.8和1.2g富含DNJ的桑叶粉末可以显著地抑制餐后血糖升高和胰岛素的分泌[22]。因此可以用来治疗糖尿病，目前许多国家将桑叶茶作为保健食品，但由于桑叶茶中的DNJ含量（100mg/100g干重）较低，而它对人体的有效剂量为6mg DNJ/60kg体重，其中DNJ含量与α-葡萄糖苷酶活性抑制有较高的相关性（r=0.84），用响应曲面优化提取嫩芽制作的桑叶茶中DNJ，当提取温度为98℃提取时间为100s可使230mL的桑叶茶中的DNJ含量达6.5mg，达到人体所需的有效剂量[2]。而Kazuhisa等[17]研究也发现，DNJ含量与α-葡萄糖苷酶活性抑制具有相关性，其相关系数r=0.901，r2=0.811（n=15）。

对老鼠研究发现通过给禁食大鼠口服从桑叶中提取的DNJ，开始大鼠血浆中DNJ含量低于检测限，但当摄入30min后血浆中DNJ含量达到最高92nmol/mL，最后在小鼠的血浆中未发现任何DNJ的代谢产物，因此口服的DNJ可以完全被消化道吸收，然后快速排出体外[23]。DNJ虽然对α-葡萄糖苷酶有很强的抑制能力，但与其他α-葡萄糖苷酶抑制剂相比较，DNJ的吸收速率快、起效迅速，但这样会导致作用持续时间短；研究发现羧甲基纤维素钠（CMC-Na）能显著改善血糖中DNJ的活性，将CMC-Na与DNJ一起使用，可以减慢DNJ的吸收、增加其活性持续时间，同时发现CMC-Na还可以改变DNJ在大鼠内的药物代谢动力学，CMC-Na可以增强DNJ调节血糖的水平[24]。而Kim等[25]通过老鼠实验研究发现，从桑叶中提取的DNJ与纯的DNJ相比，其吸收和排泄低于纯DNJ，其吸收利用率低。

2.2.2 降血脂 Kojima等[3]用富含DNJ的桑叶提取物对人体血浆脂质的影响，发现通过对甘油三酯（TG）水平≥200mg/dL的10名受试者每天3次服用含12mg DNJ的桑叶水提取物，持续12周，发现人体的血清甘油三酯（TG）下降，血蛋白也发生有利的变化。用DNJ和富含DNJ的物质喂养大鼠四周发现，DNJ和甲基-DNJ（meDNJ）可以增强脂联素mRNA在白色脂肪组织中的表达，增加血浆脂联素含量，增加腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）mRNA的表达，激活β-氧化系统，抑制脂质在肝脏中的堆积，同时发现DNJ和meDNJ的摄入没有引起肝功能障碍也没有减少氧化应激[26]。

2.2.3 抗肿瘤 通过研究DNJ对黑色素瘤B16F10细胞的抗转移机制，包括DNJ的抗转移活性细胞黏附，迁移和侵袭、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和组织基质金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）和组织基质金属蛋白酶组织抑制剂-2（TIMP-2）mRNA表达，通过流式细胞仪分析细胞表面的黑色素瘤B16F10细胞，发现DNJ显著抑制侵袭、迁移和细胞外基质的粘附，可显著降低MMP-2和MMP-9活性及mRNA表达，有效地提高了TIMP-2 mRNA的表达；此外，DNJ显著降低B16F10黑色素瘤细胞表面上的异常糖基化和唾液酸，但增加了甘露糖的水平；因此DNJ的对B16F10黑色素瘤细胞的抗转移作用机制可能是减弱其活性和表达MMP-2/9、TIMP-2的mRNA表达增强、细胞表面结合基序的改变，这些结果表明，DNJ可能是一种有用的辅助抗转移药物[4]。

2.2.4 对变形链球菌的抑制 Islam等[27]从桑叶中分离到DNJ，然后对DNJ抑制口腔致病菌变形链球菌的作用进行了评价，发现与桑叶茶粗提物相比经纯化的DNJ处理后变形链球菌的数量减少了8倍，可以强烈的抑制变形链球菌生物膜的活性，通过聚焦显微镜观察可以发现，DNJ扭曲了变形链球菌的生物膜，因此DNJ可以控制变形链球菌的过度生长和抑制生物膜的形成。

2.2.5 抗病毒 HIV病毒有两个富含糖基化的环合蛋白gp120和gp140，gp120和gp140作用是介导病毒与细胞表面受体分子接触并引起细胞融合形成合体细胞，桑叶中DNJ可以较强的抑制糖蛋白加工，改变gp120的糖基化，DNJ对莫洛尼鼠白血病毒（MoLV）抑制实验发现，DNJ可以显著抑制逆转录酶病毒的活性，其IC50为1.2～2.5μg/mL，增加DNJ剂量，抑制力增强[5]。

3 DNJ的分离提取、纯化技术和检测方法

3.1 DNJ的提取

目前使用较多的DNJ的提取主要有以下几种方法。

3.1.1 有机溶剂提取法 目前提取桑叶中DNJ最常用的方法是有机溶剂提取法，如甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂均可以用来提取桑叶中的DNJ。因为用乙醇提取用水量少，提取时间很短使得较少的水溶性杂质溶出，同时与甲醇丙酮相比，乙醇毒性相对较小，可安全使用，对仪器设备要求较低，因此乙醇提取较为常用。Islam等[27]就采用乙醇溶液对桑树中的DNJ进行了提取。也可以用纯甲醇或甲醇-水溶液对桑叶中的DNJ进行提取，但由于纯甲纯溶解性较差，因此可以加入一定量的吡啶，以加快DNJ的溶解，李宏等[28]使用吡啶∶甲醇=6∶4的比例时，可以使桑叶中的DNJ较好的溶解，从而达到好的分离效果。

3.1.2 酸提取法 DNJ是生物碱类化合物，其易溶解在酸性介质中，形成可溶性的盐而溶出，同时酸液加热后可以对植物细胞壁起到软化的作用，从而使DNJ更容易被分离提取；缺点是对含有DNJ的提取液进行浓缩较为困难。李继文等[29]用0.05mol/L的盐酸溶液25mL在80℃回流30min，经抽滤后残渣再提取一次，浓缩后即为DNJ提取液。马静等[30]对酸水提取法提取桑叶中DNJ进行了改进和优化，按一定比例的样品和酸溶液混合，并且在酸浸提后加一定量的正丁醇进行萃取，然后减压浓缩，再加入2%盐酸溶液洗涤，得到的浓缩液即为DNJ提取液。

3.1.3 微波/超声波辅助提取法 与传统方法相比，采用超声波辅助提取DNJ的优势在于可以大大缩短提取时间，提高了有效成分的得率。郑晓静等[31]用超声波辅助提取桑叶中DNJ的优化条件为提取温度48.58℃，超声波处理时间40.67min，超声波功率199.99W，固液比1∶11.97，在该条件下，DNJ的提取得率可达到99%。胡瑞君等[32]确定了DNJ的最佳提取工艺条件为：微波功率为406W、微波处理时间为1.5min、固液比（g∶mL）为1∶40、提取次数为2次。

3.2 DNJ的纯化

3.2.1 液-质联用仪分离纯化 李有贵等[33]采用液-质联用仪（LC-MS）分离纯化法对粗提的DNJ进行了纯化，主要方法为：将粗提的DNJ用蒸馏水溶解后经制备型液相色谱仪分离，质谱引导，通过质谱对收集液进行鉴定，然后50℃恒温下旋转蒸发除去乙腈，于-50℃下冷冻干燥成淡黄色粉末，即为DNJ。采用该方法纯化的DNJ经柱前荧光衍生-反相高效液相色谱法检测，纯度大于95%。

3.2.2 树脂纯化法 李宇亮等[34]采用732H阳离子树脂纯化DNJ，用蒸馏水洗至流出液为无色后用氨水洗脱，用旋转蒸发仪浓缩洗脱液，再正丁醇萃取，回收正丁醇，真空干燥，即得纯化后的DNJ，DNJ纯度可达93.2%。此外还可用磺酸型离子交换树脂法和强酸型阳离子交换树脂法进行纯化。

3.2.3 反相柱色谱纯化法 反相高效液相色谱是指以强疏水性的填料做固定相，以可以和水混溶的有机溶剂作流动相的液相色谱，是应用最广的液相色谱方法。因为DNJ属于高极性化合物，所以可采用反相色谱柱进行纯化。周惠燕等[35]采用该方法对从桑叶中粗提的DNJ进行了纯化。

3.3 DNJ的检测方法

DNJ测主要检测方法有以下几种。

3.3.1 柱前衍生化-高效液相色谱法 柱前衍生化-高效液相色谱法测定桑叶中DNJ的原理是，9-芴甲基羰酰氯（FMOC-Cl）能衍生化伯胺和仲胺，生成的衍生物具有稳定的荧光强度，而DNJ分子中含仲胺结构，在硼酸盐缓冲液（pH=8.5）的条件下，加入用乙腈溶解配制的FMOC-Cl 溶液，DNJ 与FMOC-Cl 生成DNJ-FMOC络合物，再加入甘氨酸除去多余的荧光试剂。柱前衍生化-高效液相色谱法是测桑叶中DNJ最常用的方法[29，31，33，35]。

3.3.2 HPLC-ELSD法 蒸发光散射检测器（ELSD）是一种新型通用的质量型检测器，其响应仅和被测物质的质量成正比，不依赖物质的官能团和光学特性。Toshiyuki等用HPLC-ELSD法对桑叶中的DNJ进行了测定，HPLC-ELSD法测定桑叶中的DNJ具有简单、快速、灵敏的优势，其检测限为100ng[36]。

3.3.3 高效液相色谱-串联质谱法 Dai等[37]用高效液相色谱-串联质谱法对桑叶中的DNJ进行了测定，流动相为乙腈-0.1%甲酸，色谱柱为岛津HRC-NH2柱，在多反应监测（MRM）模式下，质谱系统配备大气压化学电离（APCI）源，得出DNJ的保留时间为2.87min，在482～2410μg/L范围内标准曲线呈良好的线性关系，平均回收率为95.8%，检出限为53.6μg/L。

3.3.4 分光光度法 因为DNJ分子结构中没有双键、羰基、苯环等发色基团和助色基团，所以在紫外、可见光波段内无吸收峰，不能采用常规的分光光度法检测，但通过加入碘-碘化钾试剂，使DNJ与碘-碘化钾试剂反应生成棕红色络合物，然后就可以在在紫外条件下检测处DNJ的含量。但不同分光光度计选用的最大吸收波长却有差异，主要有284nm和334nm[30，32，34]。

3.3.5 气相色谱法和毛细管柱气相色谱法 张晓臣[38]用气相色谱法测定了桑叶中的DNJ，测定的色谱条件为：色谱柱OV-275，初温130℃×3min，以30℃/min上升至170℃，维持4min；汽化室温度200℃；检测口温度180℃；载气为N2，流速40mL/min；进样量1μL，火焰离子检测器（FID）。汪孟夏[39]用毛细管柱气相色谱法测定了桑叶中的DNJ，其色谱条件为：色谱柱OV-1701，初温285℃×5min，以10℃/min上升至295℃，维持25min，以20℃/min下降至285℃；汽化室温度310℃；检测口温度310℃；氢气流量47mL/min；进样量1μL，火焰离子检测器（FID）。

4 结论

随着人们对桑叶资源的不断开发，各种桑叶咀嚼片、桑叶茶、桑叶超微粉、桑叶片剂、桑叶饮料等产品相继问世，但对桑叶保健制品的开发绝对不限于此，随着对桑叶的深入研究希望更多的产品为人类所利用。由于桑叶和桑叶茶中的DNJ可以高效的抑制小肠糖苷酶的活性，可用于治疗Ⅱ型糖尿病，降低因酸中毒引起的心肌梗死发生率，抗肿瘤、降血脂，且对人体无明显毒副作用，因此开发更多以DNJ为主要功效成分的保健食品及药品发展前景良好。DNJ主要来源为桑叶，但利用现有技术找出其他能够合成或生成DNJ的生物资源以解决DNJ来源不足问题。由于目前DNJ的生物合成机制并不完全清楚，因此探究DNJ的合成机制，以便大规模人工生产DNJ，以弥补自然DNJ资源的不足，也是以后研究的重点。同时期望通过不断深入研究得到更高效、快速的分离提取、纯化、检测DNJ的方法。

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