反式脂肪酸与内皮细胞凋亡研究进展

邱 斌， 徐同成， 王 青， 刘丽娜，陶海腾， 刘 玮， 宋 康， 杜方岭*

（1.山东省农业科学院 农产品研究所，山东 济南 250100；2.山东杏林科技职业学院，山东 济南 250200）

内皮细胞凋亡过度是内皮细胞损伤的初始环节，在动脉粥样硬化的早期扮演了重要角色。目前国内外针对TFA对动脉粥样硬化和心血管疾病的研究主要集中在内皮细胞凋亡方面，并已有一定的研究基础。下文就反式脂肪酸与内皮细胞凋亡的研究进展作一综述。

1 反式脂肪酸

由于天然油脂缺乏稳定性并且可塑性较差，而且货架期较短，因此，为了满足食品工业对油脂的使用要求，厂家通过采用油脂的氢化工艺来提高油脂的可塑性和稳定性等。植物油脂在氢化加工的过程中，其中的不饱和双键转变为单键，与此同时，会产生部分异构化的产物TFA（反式脂肪酸），TFA是一类分子中含有一个或多个反式双键的非共轭不饱和脂肪酸[1]。其种类和含量与氢化程度、氢化条件及原料油脂中不饱和脂肪酸的含量等密切相关。TFA中主要以 tC18∶1（反油酸）为主，质量分数约占20%～50%。据国外研究报道，人类食物中的反式脂肪酸约90%都是反油酸，反油酸双键位置主要分布于△4～△16 之间， 其中主要以 9t C18∶1、10t C18∶1和11t C18∶1三种形式存在[2]。反式脂肪酸和顺式脂肪酸由于其几何空间结构的不同，因此在脂质新陈代谢过程中酶的交叉反应也相应不同[3]。

研究发现:反式脂肪酸能增加内皮损伤过程中的循环性生物标记物[4]，并削弱动脉扩张依赖物-NO的分泌量[5]。有研究证明，摄入过量的反式脂肪酸导致细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、细胞内黏附分子-1（VCAM-1）、E-选择素等的表达升高[6]。 有报道称TFA能够引起血浆总胆固醇、甘油三酯水平及脂蛋白（Lp-α）的升高，而这些因素都是与动脉粥样硬化、血栓和冠心病的形成密切相关。研究发现，TFA的摄入量每增加2%，导致患心脏疾病的危险就会急剧增加25%，等摩尔的TFA对心脏健康的危害远远超过饱和脂肪酸[7]。

2 内皮细胞凋亡

细胞凋亡（apoptosis）是正常的组织细胞在受到生理和（或）病理性刺激后，其自身内部机制激活DNA内切酶自发启动，而导致的一种细胞自发性死亡过程，它对于维持多细胞生物的器官发育、组织分化的稳定存在着重要的意义[8]。

内皮细胞数量的稳定维持和血管功能正常的保持依赖于内皮细胞凋亡与增殖之间的动态平衡[9]。但是，内皮细胞凋亡过度却是造成内皮细胞功能障碍的初始环节。Haunsteter认为，内皮细胞凋亡在早期的动脉粥样硬化过程中具有非常重要的作用[10]。Hasdai等在用高胆固醇饲养的猪冠状动脉中观察到了内皮细胞的凋亡[11]。Tricot等在动脉粥样硬化患者的粥样斑块处检测到凋亡的内皮细胞[12]。最近的研究结果表明:内皮细胞的过度凋亡是动脉粥样硬化发生和发展的生物学基础，同时也能促发急性心肌梗死、不稳定型心绞痛等急性心脏病，而且内皮的过度凋亡还能抑制血管再生，妨碍血管功能的恢复。

内皮细胞内附于血管表面，不仅是血管壁的天然屏障，而且可以分泌多种能够调节血管功能的内皮源性细胞因子[13]。因此，在发生凋亡的各种血管壁细胞中，内皮细胞凋亡的作用尤其重要。许多研究表明，细胞凋亡是动脉粥样硬化病变的主要特征之一[14]，凋亡的内皮细胞在动物模型和人体动脉粥样硬化病变中均有发现，而且几乎所有己知的致动脉粥样硬化的危险因子都能在体外实验中引起内皮凋亡；与之相反，一些抗动脉粥样硬化的因素则可阻止内皮细胞凋亡的发生。由此推测，抗AS因素是通过阻止内皮细胞凋亡而发挥作用的[15]。

研究表明，血管内皮损伤、继发性单核-巨噬细胞增多、白细胞与内皮细胞黏附及单核-巨噬细胞向内皮下迁移，是AS发生的主要病理机制之一[16]。内皮细胞凋亡作为内皮损伤的主要形式，会引发一系列复杂而又相互依存的变化，具体特征如下[17]:（1）增加血管通透性，促进单核-巨噬细胞向内皮下迁移和造成脂质在内皮下的堆积；（2）促使单核-巨噬细胞、T淋巴细胞等向内膜下浸润，使血管壁局部的肿瘤坏死因子 （tumor necrosis factor-α，TNF-α）和集落刺激因子 （colony stimulating factor，CSF）等炎症因子分泌增加，加剧内皮细胞凋亡并能诱导内皮细胞表面的细胞黏附分子表达增加，从而进一步促进炎症细胞的激活和趋化；（3）破坏血管内膜屏障，内皮细胞凋亡使下层的血管平滑肌细胞（VSMCs）直接暴露于各种炎症刺激因子的环境下，刺激VSMCs增殖及内膜下迁移，最终吞噬脂质后形成泡沫细胞。

3 Caspase家族与凋亡

Caspase是引起细胞凋亡的关键酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族，当其被相关凋亡信号途径激活后，会降解细胞内的蛋白质，使细胞走向不可逆的死亡。多数的Caspase与细胞凋亡有关，启动型Caspase （initiator Caspase）包括 Caspase-2、-8、-9能介导相应凋亡信号的转导；效应型Caspase（effector Caspase） 包括 Caspase-3、-6、-7 等通过裂解细胞内的结构蛋白以及功能蛋白等使细胞解体[18]。不同启动型的Caspase介导不同通路的凋亡信号，如Caspase-8介导死亡受体通路的相关凋亡信号，而Caspase-9则介导细胞线粒体通路的相关凋亡信号。在死亡受体通路中，Fas（死亡受体）和TNF-α（肿瘤坏死因子-α）可以激活细胞内死亡复合体相关的调节蛋白和Caspase前体（procaspase）从而形成死亡复合体，死亡复合体接下来会激活一系列的上游启动性Caspase，如:Caspase-8，这些上游启动性Caspase会激活下游的Caspase蛋白酶，细胞的凋亡主要是通过下游的Caspase促使执行的。在线粒体通路中，细胞应激可以诱导细胞色素c从线粒体脱离，脱落的细胞色素c能够与凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）结合形成凋亡小体，进而激活Caspase-9，最后由Caspase-9激活相应的下游Caspase执行酶而导致细胞凋亡。

目前，普遍的研究认为:被称为“死亡蛋白酶”的Caspase-3是细胞凋亡的最终执行酶，它是细胞凋亡Caspase级联瀑布反应的必经之路。当由多种刺激因素综合所诱导启动的信号激活Caspase-3后，存在于胞核、胞质及细胞骨架的一些重要蛋白质会因为Caspase-3的存在而降解失活，最终导致细胞的死亡。因此，可以说Caspase-3是多细胞生物细胞凋亡中的关键酶[19]。

4 内皮细胞凋亡的信号转导与Caspase

虽然由各种外界不同的刺激所诱导的内皮细胞凋亡途径和分子生物学机制各不相同，但是内皮细胞凋亡信号的转导也存在着一定的共同点。

（1）凋亡触发期:当促凋亡因素与细胞膜接触时，促死亡分子与其相应的受体结合形成复合体并激发相关死亡途径，如:[（Fas-Fasl）]-FADD 途径或{[（TNF-TNFR）-TRADD]}-FADD 途径。胞浆死亡信号衔接蛋白（FADD蛋白）的N端的死亡效应功能区（DED（与具有同源胞内功能区的Caspase-8前体（procaspase-8（的N端结合，并诱导Caspase-8前体自身裂解而被激活。虽然Caspase-8能够直接激活Caspase-3诱导细胞凋亡，但主要的诱导凋亡方式是通过线粒体途径进行信号放大，最终激活Caspase-3导致凋亡的发生[20]。

（2）凋亡决定期:bcl/Bax在正常状态下，附着在线粒体膜上通过形成异源二聚体而抑制细胞凋亡，但当凋亡信号足够强，就会引起此二聚体结构的解离，从二聚体中解离出来的Bax具有通道特性，能增加线粒体膜通透性，导致细胞色素c和Smac/DIABLO的释放，细胞色素c能够依次激活存在于胞浆中的凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）和Caspase-9 前体（procaspase-9）[21]，从而导致细胞凋亡的发生。所以在细胞凋亡的发生和发展过程中，bcl/Bax异源二聚体的形成和解离起到关键作用。

（3）凋亡效应期:此阶段主要是由Caspase-9激活Caspase级联瀑布反应。在凋亡过程中，下游执行酶Caspase-3起关键作用，它不仅可以直接激活核酸内切酶（DNase），而且还可以通过灭活内皮细胞凋亡酶抑制剂 ICAD （inhibitor of caspase activate DNase） 的活性而解除 ICAD对 CAD（caspase activate DNase）的抑制作用而激活DNase。Dnase可以切割DNA的核小体形成具有典型凋亡特征性的DNA “梯形带”，此外Dnase还能够裂解细胞核中PARP（聚腺苷二磷酸核糖多聚酶）、细胞骨架蛋白、核纤层等DNA修复蛋白，进而最终导致凋亡形态的改变。

（4）凋亡终末期:虽然细胞周围的吞噬细胞能够识别和吞噬凋亡的内皮细胞，但由于无法充分清除凋亡的内皮细胞，因此凋亡过程中会伴有继发性坏死的发生[22]。

5 TFA与内皮细胞凋亡

目前，在内皮细胞和其他细胞系都有报道FFA（游离脂肪酸）具有促凋亡效应。Martina B等发现花生四烯酸（AA）能够通过影响磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）的信号转导，诱导内皮细胞的凋亡和黏附[23]。Salvatore P等发现高浓度的游离脂肪酸（FFA）能够通过抑制Akt的磷酸化来诱导HUVEC凋亡[24]。Michaela A等发现FFA诱导内皮细胞凋亡需要Caspase酶的激活[25]。Piro等发现FFA通过激活Caspase-9来诱导内皮细胞凋亡[26]。Harvey等发现长链饱和脂肪酸能够诱导人动脉内皮细胞凋亡[27]。Sweeney等发现多不饱和脂肪酸能够诱导新生单核细胞凋亡[28]。Jiang等发现棕榈酸能够通过p38和JNK通路诱导内皮细胞凋亡[29]。Kong等发现γ-亚油酸能够通过激活Caspase-3而诱导K562/ADM细胞凋亡[30]。Piro等发现FFA诱导内皮细胞凋亡与Caspase-9的激活有关[31]。关于反式脂肪酸诱导内皮细胞凋亡的研究报道很少。Kondoh等在9tC18∶1诱导的人肝癌细胞凋亡进程中，检测到有Caspase-3和-8的激活，而Caspase-9的活性则没有变化[31]。Downar等首次报道了9tC18∶1具有诱导内皮细胞凋亡的作用[32]。在TFA诱导内皮细胞的凋亡过程中，Caspase首先在哪儿被激活?在细胞凋亡过程中有多少Caspase酶被激活?TFA通过哪条通路诱导内皮细胞凋亡?各种Caspase酶之间是如何协作的?TFA诱导内皮细胞凋亡的具体凋亡机制和相关信号通路目前仍未见报道。

6 TFA与内皮细胞凋亡信号转导通路

半胱天冬蛋白家族的Caspase在凋亡过程中起着关键作用，细胞凋亡是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。细胞凋亡的主要途径包括:（1）外界刺激因子通过胞外信号激活细胞内的Caspase级联反应；（2）线粒体损伤后，释放凋亡酶激活因子激活Caspase引发级联反应。这些被激活的Caspase能够降解细胞内的重要蛋白质，最终诱发细胞凋亡。

死亡受体通路的信号转导过程如下:当细胞受外界凋亡诱导因素诱导时，肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族成员与相应的配体（TNF家族）结合时，会导致受体生成三聚体，然后受体的胞浆部分与接头蛋白 （adapter protein）Fas-相关死亡蛋白域（fas-associated protein with death domain，FADD）和Caspase-8 前体（procaspase-8）发生聚集，Caspase-8前体通过自身或相互之间的切割从而使Caspase-8激活。当Caspases-3被Caspase-8激活后，能够接着水解 ICAD （Inhibited Caspase Activated Dnase）从而活化 CAD （Caspase Activated Dnase），最终导致细胞凋亡[33]。线粒体信号的转导通路行程如下:外界的一些凋亡刺激因素能够使线粒体膜的通透性转换孔（permeability transition pore，PTP）打开，使线粒体膜电位发生变化，促使线粒体释放凋亡启动因子（Cyto-C，AIF，APaf-l）、Smac/DIABLO 和 Caspase-3前体（procaspase-3）进入胞浆[34-37]，最终导致细胞凋亡的发生。

死亡受体通路在激活Caspase-8的同时，也可以通过激活Bcl-2家族的促凋亡因子Bid（binding interface database）而激活线粒体通路。正常状态下，Bid存在于胞浆内是没有活性的，但当被Caspase-8激活后，Bid会被切割成一种截短的Bid（truncatedBid，tBid），tBid 能够进入线粒体并破坏线粒体膜的通透性，导致细胞色素c等释放入胞浆，进一步激活Caspase-9，从而强化了Caspases级联瀑布反应[38-41]。

Caspase的激活在细胞凋亡的信号转导过程中已经被证明是必不可少的[42]。在许多生物系统中，当细胞凋亡时，无论是死亡受体通路还是线粒体通路最终都会汇集并激活Caspase-3，然后Caspase-3激活脱氧核糖核酸酶，最终导致核凋亡[43]。Caspase-3在细胞凋亡过程中起到至关重要的作用，它被认为是凋亡的“最终执行者”[44-45]。Downar等报道了反油酸（9tC18∶1）和反亚油酸能够通过激活Caspase-3诱导内皮细胞凋亡[46]。Kondoh等发现9tC18∶1能够通过激活Caspase-3、Caspase-8来诱导HepG2细胞凋亡[47]。可见TFA在不同的细胞系内能够诱导不同的Caspase的激活。Bid蛋白是Bcl-2家族中促凋亡类的蛋白质。当细胞暴露于外界促凋亡因子如肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）等环境时，被激活的上游启动酶Caspase-8将Bid蛋白切割并转化为tBid，随后tBid的C-端片段进入线粒体，诱发细胞色素c和Smac/DIABLO的释放，最终引起细胞凋亡[48-49]。有研究报道，Smac/DIABLO通过抑制IAP（细胞凋亡抑制因子）家族蛋白的表达来促进Caspase的激活[50-51]。Qiu Bin研究发现不同饱和度TFA（9tC18∶1 和 9t，12tC18∶2）首先激活死亡受体通路的上游酶Caspase-8，然后通过Bid蛋白激活线粒体通路，最终激活Caspase-9和激活Caspase-3[52]。另外，还有很多报道关于其他的刺激物通过不同通路激活 Caspase-8、Caspase-9、Caspase-3 而诱导细胞凋亡。Haefen等证明，在紫杉醇诱导BJAB（B细胞淋巴瘤细胞）细胞的凋亡过程中，Caspase-8做为线粒体通路的下游放大器起着重要的作用[53]。Lim等报道，在LPS诱导的细胞凋亡过程中，通过抑制细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和丝裂原活化蛋白激酶 p38（p38 MAPK通路），从而抑制Caspases-8，Caspases-9，Caspases-3 的激活[54]。

Martina B等发现，花生四烯酸（AA（能够通过影响磷脂酰肌醇-3-激酶 （phosphatidylinositol-3-kinases，PI3K）的信号转导，诱导内皮细胞的凋亡和黏附[17]。Salvatore P等发现，高浓度的游离脂肪酸（FFA）能够通过抑制Akt的磷酸化来诱导HUVEC凋亡[18]。Michaela A等发现，FFA诱导内皮细胞凋亡需要Caspase酶的激活[19]。Piro等发现，FFA通过激活Caspase-9来诱导内皮细胞凋亡[20]。Kondoh等发现9tC18∶1能够通过激活 Caspase-9和 Caspase-3来诱导肝癌细胞的凋亡[21]。关于反式脂肪酸诱导内皮细胞凋亡的研究报道较少，仅Zapolska报道了TFA能够诱导内皮细胞凋亡，但具体的凋亡机制没有报道[22]。

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