白藜芦醇联合5-氟尿嘧啶抗肿瘤活性的研究

李冬梅，张淑珍，车 薇，张红果

肿瘤一直是危害人类生命的顽疾之一，合理配伍生物调节剂、增效减毒是目前肿瘤治疗研究领域一个积极的探索方向，特别是中药提取物与化疗药联合应用，能够提高抗肿瘤的疗效。白藜芦醇(Resveratrol，Res)为非黄酮类的多酚化合物，广泛分布于多种植物中。近年来，国内外学者研究发现，Res具有多种生物活性，其抗肿瘤作用引起广泛关注，是最具有希望的天然肿瘤预防剂之一［1-2］。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)是肿瘤治疗常用的化疗药物，但其毒副作用较大，可造成机体免疫功能低下［3］，限制了其临床应用。本研究通过观察Res合用5-Fu的抗肿瘤活性，证实二者对肿瘤的联合治疗作用，以期为临床应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级昆明种小鼠，雄性，体质量(20±2)g，由河北省实验动物中心提供，合格证号:SCXK(冀)2008-1-003。瘤源:荷 S180肉瘤(腹水型)小鼠，为接种肿瘤细胞7 d后生长良好的荷瘤动物，由河北省实验动物中心传代保存。

1.2 药品和试剂 Res(纯度≥98%)、5-Fu(纯度≥99%)、DMEM培养基、胎牛血清、刀豆蛋白 A(ConA)、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)，均为Sigma-Aldrich公司产品。淋巴细胞分离液，密度:1.077 g/mL，Axia-Shield公司产品。DMEM培养基加入胎牛血清配成浓度10%的完全培养液;MTT用DMEM培养液配成0.5%的溶液，微孔滤膜除菌。

1.3 主要仪器 CO2恒温培养箱，TS100-F-PH型倒置荧光相差显微镜，AC100-110型酶标仪。

1.4 方法

1.4.1 药物的配制 体外试验:将Res和5-Fu分别用DMSO溶解，微孔滤膜除菌，以含10%胎牛血清的完全培养液稀释成所需浓度。体内试验:将Res和5-Fu分别用DMSO溶解，均以生理盐水稀释成所需浓度，现用现配。

1.4.2 Res合用5-Fu对体外脾细胞增殖的影响

按MTT法进行。取正常小鼠，脱颈椎处死，无菌制备单个脾细胞悬液，用培养液洗涤、悬浮沉淀，沿管壁缓缓加至淋巴细胞分离液上，离心，取液体中间层呈云雾状的淋巴细胞，用培养液洗涤，以含10%胎牛血清的完全培养液悬浮沉淀，置37℃、5%CO2培养箱中培养。培养12 h后，倒置显微镜下观察细胞状态。加入完全培养液至细胞含量为107/mL。在96孔细胞培养板中，每孔加入细胞悬液100 μL，培养12 h后，分别加入50 μL 系列浓度的药物，药物组分为 Res组(0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)、5-Fu 组 (0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)、Res+5-Fu 组。再加入 50 μL ConA(终质量浓度 10 μg/mL)，空白组加入等体积的DMEM培养液，每个样品均设3个复孔。继续培养，于68 h取出培养板，每孔加入MTT液20 μL，继续培养4 h，吸弃上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡5 min，酶标仪490 nm处检测OD值。

1.4.3 Res合用5-Fu对S180抑瘤活性的影响将荷瘤小鼠(瘤株)脱颈椎处死，于无菌条件下吸取腹水，按照腹水∶生理盐水=1∶4的比例进行稀释，将稀释后的腹水按每只0.2 mL(肿瘤细胞数约5×109/L)接种于动物右侧腋窝皮下。接种后24 h，按体质量随机分为4组:模型组(等量生理盐水)、Res组(20 mg/kg)、5-Fu 组(20 mg/kg)、Res合用5-Fu组(Res 20 mg/kg+5-Fu 20 mg/kg)，每组10只。各组均腹腔注射给药，1次/d，连续10 d，每天观察小鼠的活动情况。末次给药24 h后，各组动物称重，脱颈椎处死，取瘤体称重并比较各组差异，计算抑瘤率:抑瘤率(%)=［(模型组平均瘤重-给药组平均瘤重)/模型组平均瘤重］×100%;另取胸腺和脾脏称重，计算胸腺指数和脾指数。

1.5 统计学处理 采用SPSS 15.0软件进行分析，数据以±s表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Res合用5-Fu对体外脾细胞增殖的影响Res单用剂量≥0.1 μg/mL，5-Fu单用剂量≥0.1 μg/mL，以及二者合用时，对淋巴细胞增殖均表现出较强的抑制活性(P＜0.05或P＜0.01)，且抑制作用随药物浓度的增加而提高。结果见表1。

表1 Res合用5-Fu对ConA诱导的脾细胞增殖的影响(n=3)

2.2 Res合用5-Fu对S180荷瘤小鼠的抑瘤作用

各药物组荷瘤小鼠的体质量增长均较模型组低，其中Res合用5-Fu组与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。各药物组瘤重与模型组相比均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，Res合用5-Fu组与单用组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。Res合用5-Fu的抑瘤率达到41%，明显大于单用Res或5-Fu。结果见表2。

表2 Res合用5-Fu对S180荷瘤小鼠体质量及瘤重的影响

2.3 Res合用5-Fu对S180荷瘤小鼠免疫器官的影响 单用Res对免疫器官指数影响不显著，单用5-Fu可导致免疫器官肾脏和胸腺出现不同程度的萎缩(P＜0.05或P＜0.01)。Res合用5-Fu可提高脾指数和胸腺指数，与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与5-Fu组比较差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。结果见表3。

表3 Res合用5-Fu对S180荷瘤小鼠免疫器官的影响

3 讨论

由于放化疗不良反应严重，寻找以增效减毒为目标的多元化肿瘤治疗方案是目前抗肿瘤领域的重要研究课题之一。目前，国内外已对Res预防和抑制肿瘤的作用进行了较为深入的研究，发现Res对乳腺癌、胃癌、白血病、鼻咽癌、肝癌、大肠癌等都有较好的抑制作用［4-5］;对肿瘤细胞具有选择性作用，可在不同阶段通过抑制肿瘤始发的突变、抑制肿瘤细胞的增殖、诱导肿瘤细胞的凋亡等方面起作用［1，6］。5-Fu是临床上治疗肿瘤的常规化疗药物，但该药在杀伤瘤细胞的同时，也导致肿瘤患者免疫低下［7-8］，而免疫功能低下又可促进肿瘤的发生和发展。本研究探讨了二者联合应用的抗肿瘤作用。

本研究通过观察Res合用5-Fu对ConA诱导小鼠脾细胞增殖的影响，结果表明，Res合用5-Fu对小鼠脾细胞增殖有显著的抑制作用，且其作用随浓度增加而增强;陈素梅等［9］研究认为，Res与化疗药联合应用，可明显加强对胰腺癌细胞增殖和凋亡的抑制，比单用抑制作用更强。本研究通过观察Res合用5-Fu对小鼠移植性肉瘤S180的抑制作用，结果表明，Res合用5-Fu能明显抑制荷瘤小鼠的实体瘤重，抑瘤率高于单用Res或5-Fu，说明二者联合使用有一定的协同作用。这与孙中杰等［10］的研究结果相似，其研究认为，Res在体内具有抑制小鼠肝癌H22的作用，与5-Fu联合具有协同作用，能够增强5-Fu抑制小鼠肝癌H22的作用。改善免疫功能低下也有利于肿瘤治疗。本研究发现，Res合用5-Fu对5-Fu所致的免疫器官萎缩有保护作用，提示二者配伍增强了荷瘤小鼠对肿瘤和外界刺激的反应能力。这与刘红山等［11］认为，Res对5-Fu所致小鼠白细胞减少、免疫器官萎缩等毒副反应具有保护作用的研究结果一致。

综上所述，Res与5-Fu联合应用具有较好的抑瘤效果，并能影响动物的免疫功能，说明二者合用抗肿瘤有协同作用。

［1］ 张秀`娟，蒋世超，季宇彬.白藜芦醇对 S180荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的研究［J］.中成药，2012，34(2):348-350.

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［9］ 陈素梅，熊光苏，吴叔明.白藜芦醇和吉西他滨联合用药对人胰腺癌细胞作用的研究［J］.胃肠病学，2012，17(4):212-216.

［10］ 孙中杰，于良，潘承恩，等.白藜芦醇与氟尿嘧啶对小鼠肝癌的联合治疗作用［J］.中华肝胆外科杂志，2004，10(10):696-698.

［11］ 刘红山，潘承恩，齐咏，等.白黎芦醇合用5-FU对小鼠移植肝癌H22生长的影响［J］.世界华人消化杂志，2002，10(1):32-35.